菌果聚糖合成酶(levansucrase)是一种以蔗糖为底物,催化产生菌果聚糖(levan)的微生物酶,其催化产物中还伴有葡萄糖、果糖和低聚果糖等副产物。菌果聚糖在食品、医药等领域具有非常重要的应用价值,而来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的BA-SacB1因其催化活性较高,稳定性好等特点而具有一定的生产应用潜力。但是到目前为止,对该酶的催化机理的研究仍未见报道,因此本研究将首先采用生物信息学分析方法,选择与催化活性可能相关的氨基酸位点,并通过定点突变和酶活性分析实现对该酶催化机理的初步探索。同时,本实验还通过信号肽的删除研究了该酶在大肠杆菌表达过程中对酶活性、稳定性和分泌表达的影响。此外,本研究还通过序列差异比对,查找到该酶与来源于日本盐盒菌(Haloarcula japonica)的菌果聚糖合成酶相比,存在一段“冗余”区段,并通过重叠延伸PCR方式删除了该区段,同时研究了该区段删除后对BA-SacB1酶学特征的影响。该研究对于揭示该酶的催化机理和分子进化规律具有重要意义,其相关研究也未见报道。解淀粉芽孢杆菌BA-SacB1的活性,特别是催化产生菌果聚糖的活性仍有待进一步提高。而分子定向进化是近年来实现酶定向改造的非常重要的技术手段,尤其重要的是,该技术在不需要了解酶的催化机理的前提下同样有效。分子定向进化实现菌果聚糖合成酶分子定向进化的研究至今未见报道,主要原因可能是该酶的催化过程缺乏有效、高通量的筛选方法。针对这一问题,本研究将葡萄糖试剂盒应用于菌果聚糖合成酶酶活的测定,首次建立起了高通量的筛选策略。在此基础上,通过易错PCR方法构建了BA-SacB1随机突变库,并首次探索和实践了菌果聚糖合成酶的分子定向进化。目前,已经筛选到了一些有活性的菌株,进一步的分析正在进行当中。本实验室曾尝试采用经典分子克隆方法实现BA-SacB1的克隆,但是一直未能成功。针对这一难题,本研究建立起了一种改进的克隆方法,即两步连接法,可以显著提高克隆效率,从而顺利实现了该基因的克隆和突变。在此基础上,本研究还对该方法进行了优化,并证明本方法不仅对粘性末端DNA分子克隆非常有效,即使对克隆效率很低的平末端DNA克隆及融合基因构建也同样高效。因此,该方法的建立不仅解决了BA-SacB1基因克隆的难题,也可以作为经典分子克隆技术的有力补充,对同类研究具有重要的借鉴价值。