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第一部分体外定向诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究研究目的本实验使用胚胎干细胞H9细胞系,采用化学成分明确的诱导分化培养基诱导人ESCs定向心肌细胞分化,为后续实验奠定实验模型和理论基础。研究方法人ESCs细胞复苏后,接种至含有生长因子的Matrigel胶上,用E8培养基培养ESCs,待细胞汇合度达90%以上时,换用化学成分明确的CDM3诱导分化培养基,连续培养7天至出现跳动的心肌细胞,诱导过程中观察细胞状态,用细胞免疫荧光检测心肌细胞成熟的标志物c TNNT2。研究结果诱导第7天出现跳动的心肌细胞,跳动的细胞数量逐渐增加,第14天达高峰,细胞免疫荧光显示:跳动细胞心肌特异性标志物c TNNT2表达阳性,并且可以看到肌节和闰盘结构。研究结论化学成分明确的CDM3分化培养基能够成功的诱导人ESCs分化为心肌细胞。关键词人胚胎干细胞心肌细胞定向心肌分化第二部分Apelin13对人胚胎干细胞定向心肌细胞分化的实验研究研究目的探索Apelin13对人胚胎干细胞定向向心肌分化效率的作用。研究方法h ESC单层培养,经EDTA消化后传代,应用化学成分明确的诱导分化培养基对观察组(加100nmol/L Apelin13)和对照组(不加Apelin13)定向诱导hESCs向心肌细胞分化。于诱导第2天(中胚层阶段)、第4天(心肌分化初始阶段)、第7天(心肌分化末阶段)作为时间节点,采用实时荧光定量PCR检测两组Brachury T、Mesp1、NKx2.5、APJ m RNA表达水平,采用Western Blot检测两组Brachury T、Mesp1、NKx2.5、APJ、Nanog、Sox2蛋白表达;同时于诱导第7天采用细胞免疫荧光技术检测两组心肌细胞标志物肌钙蛋白T2(TNNT2)、α-辅肌蛋白(α-Actinin)表达。研究结果在hESCs定向分化为心肌细胞过程中,Apelin13的加入能够促进细胞分化,在诱导7天左右观察最为明显。相比于对照组,荧光定量PCR的结果显示Apelin13能够明显促进诱导第2天时Brachury T和Mesp1以及诱导第7天时Nkx2.5和APJ的m RNA水平。Western Blot结果显示,Apelin13能够提高诱导第2天时Brachury T、诱导第4天时Mesp1以及诱导第7天时Nkx2.5和APJ的蛋白表达水平。同时,诱导分化2天后,hESCs的标志蛋白Nanog和Sox2的表达水平明显降低。免疫荧光结果显示,实验组和对照组诱导分化第7天的心肌细胞均具有明显的TNNT2和α-Actinin表达。进一步的实时荧光定量PCR结果显示,诱导分化第7天时实验组中TNNT2和α-Actinin的表达均显著高于对照组(P均<0.05)。研究结论在hESCs定向心肌分化过程中,Apelin13可提高hESCs向心肌细胞分化效率。