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家蚕限性卵色系卵1(简称L1)是俄罗斯科学家Strunnikov利用辐射诱变技术,将位于10号染色体上的正常卵色控制基因+w2(第二白卵,10-16.1)易位至W染色体上,而原来10号染色体上的卵色控制基因发生隐性突变(纯合为白卵)培育而成的。1996年浙江省农科院从俄罗斯引进该品系,并对其进行改良繁育,但对其卵色控制基因至今没有研究。本实验利用图位克隆技术对家蚕限性卵色系L1的10号染色体的隐性卵色突变w2进行克隆,并结合生物信息学技术对限性卵色品系的卵色控制机制进行了研究,获得结果如下：1.隐性卵色突变基因w2的定位根据家蚕p5010号染色体上scaffold44和scaffold30的基因组序列,设计167对特异性SSR引物,用于筛选限性卵色系L1和p50之间的多态性,获得19个差异标记,并用杂交后代F1雄进行验证。用这些差异标记对L1×(L1×p50)回交BC1中白卵雄蛾的基因型进行分析。通过对作图群体BC1中白卵雄蛾的基因型检测,构建了w2与SSR标记之间的连锁图,结合SSR标记在10号染色体物理图谱中的位置,最终将w2定位在物理图谱15.53Mb～15.98Mb即约0.45Mb范围内。2.正常卵色控制基因+w2全长序列的获得及生物信息学分析利用生物信息学和RACE相结合的方法获得正常卵色控制基因+w2全长cDNA序列,含有2053bp, ORF包含2013个碱基,预测蛋白序列含有670个氨基酸残基。通过对p50品系中+w2基因组结构分析发现,该基因由14个外显子和13个内含子组成,所有外显子-内含子边界都符合GT/AG规则；起始密码子位于第一个外显子,终止密码子在最后一个外显子中。预测分析发现,该基因编码的蛋白质具有典型的ABC_trans和ABC2_membrane结构域,属于ABC载体蛋白,经同源分析表明家蚕+w2为果蝇scarlet同源基因,该基因突变会产生白卵、白眼性状。3.限性卵色系L1中隐形卵色突变基因w2突变分析利用RT-PCR的方法克隆限性卵色系L1中隐性卵色突变基因w2基因mRNA序列,寻找突变位点,经序列比对发现,在w2基因的3’端最后一个外显子区域有136nt的插入片段；在DNA水平上,相应编码区段有与此插入序列一致的插入片段,然而在3’末端非编码区域却有216nt的缺失。对突变基因编码的氨基酸序列进行分析发现,此插入序列造成蛋白末端正常的16个氨基酸残基FHLLALLALRYRTRRK被19个新的氨基酸残基LGRQRLGSAPGIAEVHGRR取代,致使突变蛋白碳末端二级结构发生变化。