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目的:神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤,具有恶性程度高、易复发、预后差等临床特点。多年来,诊断检查一直是胶质瘤面临的重要课题之一,准确及时的诊断对于后期控制病情、提高综合治疗效果有重要意义。研究表明,胶质瘤高死亡率的一个重要原因就在于肿瘤细胞高度侵袭能力,这也是胶质瘤的典型生物学特性[1]。其侵袭过程同其他颅外肿瘤一样,经历了粘附、降解、移动三个步骤,即瘤细胞粘附到细胞外基质(Extracellular matrix,ECM),并分泌蛋白酶将局部基质降解,然后伸出伪足向被降解的区域运动。基质金属蛋白酶2(MMP-2)既是降解细胞外基质(ECM)成分的重要酶类,在肿瘤的侵袭过程中起重要作用[2]。有研究指出胶质瘤的级别即恶性程度与其中MMP-2表达强度有关,恶性程度越高,免疫组化结果显示MMP-2阳性表达强度也随之增高[3]。磁共振成像因其优越的软组织分辨率和对比度,一直是脑胶质瘤诊断和治疗首选的成像技术。而可作为磁共振成像对比剂的超小超顺磁性氧化铁颗粒(Utrasmall Superparamagnetic Iron Oxide,USPIO)具有较常规MRI造影剂更高的敏感性及饱和磁性,弛豫率是同样条件下常规MRI造影剂的7-10倍[4],且直径不到20nm,可以避免被内皮网状系统(RES)吞噬。通过对其表面进行修饰,可用于带有特定分子的细胞组织显像[5],它能够降低MRI T2的信号强度[6,7],且USPIO的毒副作用较低,在进入人体血浆铁池后可被降解,继而被细胞所代谢[8-11]。本实验设计利用基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的多克隆抗体Ab-MMP-2与超小超顺磁性氧化铁颗粒(Utrasmall Superparamagnetic Iron Oxide,USPIO)偶联,形成一种具有特异性靶向功能的分子影像探针Ab-MMP-2-USPIO,并对该分子探针的免疫活性、细胞毒性以及与大鼠胶质瘤细胞的特异性结合能力等进行体外检测,探讨其在脑胶质瘤的磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)分子影像学诊断中应用的可行性及有效性,为脑胶质瘤的诊断提供新的思路和方向。方法:第一部分:检测三种细胞系中基质金属蛋白酶2的表达情况分别采用免疫荧光法及蛋白质印迹法检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)在大鼠星形胶质细胞系(RA)、大鼠胶质瘤细胞系(C6)和人星形胶质瘤细胞系(U87)中的表达情况;第二部分:利用碳二亚胺(EDC)法将基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的多克隆抗体Ab-MMP-2与超小超顺磁性氧化铁颗粒(USPIO)偶联,制备分子影像探针Ab-MMP-2-USPIO;第三部分:检测合成后分子探针(Ab-MMP-2-USPIO)的生物活性及其与靶细胞的特异性结合能力;1采用Western blotting法检测合成后的Ab-MMP-2-USPIO分子探针的免疫活性;2 MTT比色法检测不同浓度(0、25、50、75、150、300、600ug/ml)的Ab-MMP-2-USPIO分子探针对于正常大鼠星形胶质细胞(RA)的细胞毒性;3 Annexin V-FITC/PI流式细胞双染法检测浓度为75 ug/ml的Ab-MMP-2-USPIO分子探针对于正常大鼠星形胶质细胞(RA)以及大鼠胶质瘤细胞(C6)的致凋亡作用;4运用普鲁士蓝染色法检测浓度为75 ug/ml的Ab-MMP-2-USPIO分子探针与大鼠胶质瘤细胞(C6)中MMP-2蛋白的特异性结合能力。结果:1免疫荧光法结果显示MMP-2蛋白在大鼠星形胶质细胞(RA)内没有特异性荧光表达,但在大鼠胶质瘤细胞(C6)和人星形胶质瘤细胞(U87)的胞质内呈高表达状态;Western blotting结果可见大鼠胶质瘤细胞(C6)和人星形胶质瘤细胞(U87)组均出现条带,证实了两种细胞中MMP-2蛋白的表达,但正常大鼠星形胶质细胞(RA)组未检测出MMP-2蛋白表达。2在对合成的分子探针Ab-MMP-2-USPIO的检测中:Western blotting结果显示Ab-MMP-2-USPIO与MMP-2蛋白有着较高的结合度,与该抗原的多克隆抗体Ab-MMP-2相似;MTT比色法结果显示Ab-MMP-2-USPIO的细胞毒性低,超过150ug/ml的剂量培养72h才出现明显的细胞毒性,后续实验中所采用的浓度(75ug/ml)对于正常大鼠星形胶质细胞无明显毒性,处于安全水平;Annexin V-FITC/PI流式细胞双染法检测结果显示浓度为75ug/ml的Ab-MMP-2-USPIO与正常大鼠星形胶质细胞(RA)以及大鼠胶质瘤细胞(C6)共培养48h和72h均不会致明显的细胞凋亡;普鲁士蓝染色的结果显示,相对正常大鼠星形胶质细胞(RA),大鼠胶质瘤细胞(C6)细胞能够大量摄取Ab-MMP-2-USPIO。结论:体外实验的结果表明,MMP-2蛋白在正常大鼠星形胶质细胞(RA)中不表达,在胶质瘤细胞系C6和U87细胞中高表达,且人工合成的Ab-MMP-2-USPIO分子探针对细胞的毒性较小,致凋亡效果不明显,同时与大鼠胶质瘤细胞(C6)有着较高的特异性结合能力。为进一步的体内实验奠定了基础,有望成为提高脑胶质瘤MRI诊断准确性的新型靶向纳米核磁共振造影剂。