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小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants, PPR)由副粘病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants virus, PPRV)引起,以发热,眼、鼻有大量浆性分泌物、溃疡和坏死性口腔炎,胃炎,腹泻和肺炎为特征的一种严重的烈性、接触性传染病。主要感染小反刍兽,特别是山羊和绵羊高度易感。PPR严重威胁着动物卫生安全和畜牧业的发展,是需要采取严厉的强制预防,控制和扑灭的动物疫病之一。2007年7月,我国西藏自治区阿里地区日土县发生PPR疫情,这是我国首次发生PPR。疫情发生后,立即对疫区及周边地区的绵羊、山羊接种小反刍兽疫Nigeria75/1疫苗进行预防免疫,但是弱毒株的存在可能会干扰PPR的血清学调查,导致无法与野毒感染进行区分。
针对上述情况,本研究采用根据H基因的多变区域设计特异性引物H1a/H2b联合OIE规定的基于N基因检测PPRV的标准通用引物NP3/NP4,建立区分PPRV野毒株与疫苗株的联合RT-PCR方法。结果表明,针对N基因的RT-PCR方法能同时检测PPRV野毒株与疫苗株;而针对H基因的RT-PCR方法只能检测PPRV4系野毒株,不能检测PPRV疫苗株。根据2次RT-PCR反应的结果,能够很好的区分PPRV4系野毒株与疫苗株。而且可检测到的最低模板量可达7.7×10-3 ng/μl,该值完全可以满足作为诊断方法的要求。总之该检测方法可以成功的扩增出国内流行的毒株,专一性好,灵敏度高,准确度高,因此有潜力用于兽医临床上小反刍兽疫病毒疫苗毒与野毒的鉴别诊断。
根据Genbank中发表的PPRV基因序列,我们设计14对扩增引物、91条测序引物运用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获取了覆盖岩羊分离株(简称Tibet/07-Y)全基因组的14个重叠片段。病毒RNA的5’及3’端的序列通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)获取。该Tibe/07-Y分离株全长为15948bp与已发表的PPRV毒株序列长度相同,全基因组编码6种结构蛋白,各个蛋白的基因起始、终止序列在进化上的保守性很高。与PPRV基因4系毒株PPRV/China/Tibet/Geg/07-30(简称Tibet07-30)、Turkey2000,基因2系毒株Nigeria75/1与Nigeria76/1,基因1系毒株C(o)te d Ivoire89的核苷酸同源性分别为99.7%、92.6%、89.5%。
对Tibet/07-Y的H基因进行分子生物学特征分析,发现H基因由1957个核苷酸组成,编码区有1830个核苷酸共编码609个氨基酸,与其他PPRV分离株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88.6%-99.7%和89.3%-99.7%。与麻疹病毒属的其他病毒的核苷酸和氨基酸同源性为46.2-54.8%和33.4-55.2%。H蛋白的疏水区高度保守,N末端锚定区由38-58个氨基酸组成。H蛋白含有13个半胱氨酸残基、37个脯氨酸及四个潜在的N-糖基化位点,分别命名为N172 KSK175、N215 VSS218、N279MSD282、N18KTH21。