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研究背景膀胱癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率均居泌尿系统肿瘤首位。表观遗传学调控机制在化学致癌的发生发展过程中发挥重要作用,N6-腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)修饰是最常见、最丰富的信使RNA(mRNA)修饰,是发生在腺嘌呤第六位N原子上的甲基化修饰,在mRNA内部碱基甲基化修饰中所占比例最大,其影响mRNA代谢的所有基本方面。近期研究发现,甲基化转移酶3(Methyltransferase-like protein 3,METTL3)编码的蛋白具有RNA甲基化转移酶的功能,并在脂肪形成、精子形成、发育、癌变、干细胞更新和其他疾病中起重要调控作用。镉是人类职业和环境中广泛接触的金属元素,国际癌症研究机构已将其列为人类已确定致癌物。镉致癌机制极其复杂,由于其低诱变性和强致癌性,近年来的研究多集中于表观遗传机制的探讨。目前,m6A甲基化转移酶METTL3对肿瘤发生及发展的影响尚未明确,且其在镉诱导的细胞恶性转化过程中所起作用也尚未可知。研究目的探讨m6A甲基化转移酶METTL3在人膀胱癌细胞中的表达情况及其功能,明确METTL3在氯化镉诱导的细胞恶性转化中所起的作用,为膀胱癌RNA甲基化表观遗传调控研究奠定新的理论基础,并为其RNA表观遗传防治镉化学致癌提供新的策略。研究方法1.检测人膀胱癌组织与对应癌旁组织中METTL3基因的表达水平,利用TCGA数据库查看METTL3在膀胱癌组织和对应癌旁组织中表达量差异情况。2.检测人正常膀胱细胞株和膀胱癌细胞株METTL3蛋白的表达水平,选取人膀胱移行上皮细胞SV-HUC-1和膀胱癌细胞,采用Western blot检测人永生化膀胱移行上皮细胞和各膀胱癌细胞系中METTL3的蛋白表达差异。3.构建METTL3敲除和过表达载体,转染至293T细胞,提取基因组DNA采用T7E1实验筛选切割效率最高的靶序列,连接到LentiCRISPRV2慢病毒敲除质粒上构建敲除 METTL3 的 LentiCRISPRV2-METTL3 载体;使用 PCR 仪扩增 METTL3 基因 CDS区全长,连接到PLEX慢病毒过表达质粒上构建过表达METTL3的PLEX-METTL3载体。4.建立METTL3敲除和过表达的稳定细胞株,将LentiCRISPRV2-METTL3和PLEX-METTL3分别转染至293T细胞生产病毒液,感染SV-HUC-1细胞和T24细胞,加入嘌呤霉素筛选阳性克隆株,建立过表达METTL3基因的稳定细胞株SV-HUC-1-METTL3和敲除METTL3基因的稳定细胞株T24-KO-METTL3,并采用Western blot 检测 SV-HUC-1-METTL3 和 T24-KO-METTL3 细胞的 METTL3 蛋白水平的表达。5.敲除和过表达METTL3对人膀胱上皮细胞表型的影响。MTS法检测细胞增殖情况;流式细胞仪法分别检测细胞周期和细胞凋亡情况;细胞划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell小室结合Matrigel模拟细胞侵袭时穿越的膜结构检测细胞侵袭能力。6.利用课题组前期构建氯化镉诱导SV-HUC-1细胞恶性转化模型的方法,应用相同方法构建氯化镉诱导METTL3过表达型SV-HUC-1细胞恶性转化模型。氯化镉(10μmol/L)持续处理METTL3过表达组SV-HUC-1细胞及其对照组细胞6w,检测相关体外细胞表型变化,以确定METTL3在细胞恶性转化中所起的作用。7.统计学方法,上述所有的实验数据来自三次独立重复的实验结果。使用GraphPad Prism6软件进行绘图。统计学分析采用SPSS18.0软件进行,数据采用均数±标准差的形式表示,两组数据间比较采用t检验进行分析,P<0.05表示差异具有统计学意义。研究结果1.通过查找TCGA数据库发现,与对应癌旁组织相比,METTL3基因在人膀胱癌组织中相对高表达(P<0.05)。2.Western blot检测人膀胱移行上皮细胞SV-HUC-1和膀胱癌细胞,发现METTL3在膀胱上皮细胞SV-HUC-1中表达最低,在膀胱癌细胞T24中表达显著增高。3.经测序验证,成功构建敲除METTL3的LentiCRISPRV2-METTL3和过表达METTL3 PLEX-METTL3 载体。4.基因测序检测T24-KO-METTL3细胞在基因水平敲除METTL3,Western blot检测其METTL3蛋白表达缺失,SV-HUC-1-METTL3细胞METTL3蛋白表达显著增加。成功构建过表达METTL3基因的SV-HUC-1-METTL3稳定细胞株和敲除METTL3的T24-KO-METTL3稳定细胞株。5.MTS检测结果显示,与对照组相比,SV-HUC-1-METTL3组细胞增殖速度增加,而T24-KO-METTL3组比T24-V2组细胞增殖速度减慢;对于各组细胞周期,SV-HUC-1-METTL3 组比 SV-HUC-1-control 组 G0/G1 期减少,S 期和 G2/M 期增加,而T24-KO-METTL3组比T24-V2组G0/G1期增加,S期和G2/M期减少;对于各组细胞凋亡水平,T24-KO-METTL3组比T24-V2组凋亡率增加;对于细胞迁移能力,在0 h时,各组细胞划痕面积基本相等,在24h SV-HUC-1-METTL3组的划痕愈合面积大于SV-HUC-1-control 组,而 18hT24-V2 组伤口 已基本愈合,T24-KO-METTL3 组伤 口尚未愈合;Transwell小室结合Matrigel胶检测细胞侵袭能力,T24-KO-METTL3组穿透Matrigel胶细胞数量显著少于对照组细胞,差异均具有统计学意义。6.成功构建氯化镉诱导的METTL3过表达组恶性转化细胞SV-HUC-1-METTL3-6W-Cd模型;过表达METTL3组恶性转化细胞增殖能力增强,过表达METTL3组恶性转化细胞迁移能力增强,及过表达METTL3组恶性转化细胞侵袭能力显著增强。研究结论1.m6A甲基化转移酶METTL3在人膀胱癌组织及人膀胱癌细胞中高表达。2.METTL3促进膀胱癌细胞生长、增殖、转移和侵袭,抑制肿瘤细胞凋亡。3.METTL3促进氯化镉诱导的人膀胱上皮来源细胞的恶性转化。