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糖尿病肾病(DN)是糖尿病最严重的合并症之一,发病率呈逐年上升的趋势,目前已成为终末性肾脏疾病发生的的第二位重要因素。由于其高致残致死率,已严重影响人民的健康生活,因此,对糖尿病肾病的防治及延缓治疗研究具有重要意义。糖尿病肾病发生的诱因十分广泛,多与人类遗传基因及生活水平习惯相关,相关研究报道重金属镉与DN的发生有关,但其具体作用机制尚未明确。黄芪甲苷是黄芪中重要的作用成分之一,具有促进机体代谢降血糖、清除自由基及减少足细胞损伤等生物活性,但黄芪甲苷对镉致糖尿病肾病的保护作用未见报道。本课题研究主要通过网络药理学预测黄芪甲苷治疗糖尿病肾病的作用机理及途径,筛选出黄芪甲苷和糖尿病肾病的共同作用靶点,找到黄芪甲苷治疗DN的基本作用机理及过程,再构建DN模型并结合组织形态学、代谢组学及分子生物学来研究黄芪甲苷的保护效果。先通过构建DN模型明确镉和高脂高糖饮食不同处理条件下对DN的影响。后期再给予不同剂量的黄芪甲苷保护后研究其量效关系确定最佳给药剂量。基于代谢组学技术比较空白组、DN模型组和黄芪甲苷保护组的较显著的潜在生物标记物,结合分子生物学分析,来探讨黄芪甲苷的保护机制。分子生物学技术研究对应通路蛋白的表达情况及基因的变化情况,对DN的发病途径和黄芪甲苷进一步可能保护机制进行研究。所以本课题旨在探讨黄芪甲苷对镉致糖尿病肾病的药物效果及其可能机制,从而进一步为DN的预防和治疗提供理论依据和数据参考。相关内容如下:1.网络药理学预测黄芪甲苷治疗糖尿病肾病的作用机理及途径(1)糖尿病肾病及黄芪甲苷共同作用靶点的筛选通过数据库分析检索发现糖尿病肾病2573个、黄芪甲苷的作用靶点102个,通过去除假阳性基因和重复基因可筛选出黄芪甲苷治疗糖尿病肾病的共同作用靶点共59个。(2)构建共同蛋白相互作用网络图通过STRING数据库分析,可以构建出蛋白相互作用网络图,体现蛋白与蛋白之间内在的相互关系。(3)生物过程及通路分析DAVID数据库分析可得,在黄芪甲苷治疗糖尿病肾病的生物过程中主要涉及有ATP结合,RNA聚合酶11启动子转录、内皮细胞增殖等生物过程,KEGG富集分析可看出其主要涉及的通路有PI3K/AKT通路,mTOR通路、FOXO通路等。(4)靶标-通路网络图构建构建蛋白靶点-通路图,可直观的看出相关靶点与通路之间的关系,其中以PI3K/AKT通路为主。2.糖尿病肾病小鼠模型的构建以及黄芪甲苷保护效果研究(1)镉诱导糖尿病肾病损伤模型的建立及验证生理指标研究表明与Con组相比较,DN组空腹血糖值相对升高30%(p<0.05),饮食量及饮水量也表现出升高趋势,体重却明显下降,“三多一少”的糖尿病初步特征较一致。而在糖脂代谢水平上,DN组的TG含量与Con组比较也有所升高(p<0.05)HDL表现出显著降低30%(p<0.01),而LDL含量相对有所升高(p<0.01)。研究肾脏功能指标发现,与Con组相比较,DN组的NAG、BUN含量明显有所升高(p<0.01,p<0.01),CER及肾脏系数也表现出趋势一致(p<0.01,p<0.05)。显示氯化镉和高脂高糖饮食联合应用对小鼠均具有损伤效果,当联合应用时损伤效果产生叠加效应。(2)黄芪甲苷(Ast)对DN小鼠的保护作用研究生理指标分析显示,保护组小鼠体重与DN组比较上升明显,饮水量及饮食量有所下降,且空腹血糖与Con组相接近且有所下降,其中ASTH组的表现最明显。同时在糖脂代谢层面上,其中ASTH组的TC含量与DN组比较显著降低(p<0.05),而HDL含量有所明显升高(p<0.05)。通过肾功能指标发现,其中ASTH组NAG、CRE和BUN水平与DN组比较均表现出明显降低趋势(p<0.01,p<0.01,p<0.05)。表明黄芪甲苷对DN小鼠的治疗时药效比呈线性关系,其中高剂量保护效果较好。(3)组织形态学观察分析H&E、Masson和PAS三染色可直观发现小鼠肾脏组织中的内在病理变化,其中DN小鼠肾脏中间质炎症细胞浸润明显,肾小球系膜增生且有间质水肿发生。ASTH组小鼠肾小球结构基本完整且损伤有所恢复,组织形态接近小鼠正常状态。而肾脏透射电镜观察表明,DN小鼠肾脏中出现足突肥大且线粒体异常增多,ASTH组小鼠形态结构排列规整,上述损伤有所恢复。表明黄芪甲苷可以对DN小鼠肾脏损伤具有保护作用。3.基于代谢组学研究黄芪甲苷对糖尿病肾病的保护效果液质联用技术和气质联用技术对小鼠血清样品研究表明,Con组、DN组和AST组显示出各组内较好的聚集度且组间分离度较大趋势。根据代谢数据库筛选出相关脂质类LysoPI(18:0/0:0)等及胆汁酸类、酰胺类等多种类型的差异性代谢标记物。且分析发现甘油磷脂代谢、胆汁酸代谢等代谢通路发生明显改变。推断DN的发病因素可能与线粒体代谢障碍有关。4.基于足细胞功能蛋白Desmin和LC3蛋白及AMPK/PI3K/AKT/mTOR通路研究黄芪甲苷对DN小鼠的保护作用a.足细胞功能Desmin和LC3蛋白与Con组比较,DN组Desmin蛋白含量显著有所增加(p<0.01);LC3II/LC3-1蛋白表达量有所上调(p<0.05)。与DN组相比,保护组的Desmin蛋白表达量显著下降(p<0.01);LC3II/LC3-1蛋白表达量显著下调(p<0.05)。说明DN小鼠足细胞LC3II相关自噬蛋白升高,线粒体损伤严重,黄芪甲苷可以激活LC3-1蛋白对线粒体损伤的泛素化影响,致使线粒体自噬活动的正常发生。b.AMPK_PI3K/AKT/mTOR通路与空白组相比,DN小鼠的AMPK蛋白表达量显著上调(p<0.01);p-PI3K/PI3K蛋白表达量下调(p<0.01);p-Akt/Akt蛋白表达量显著下调(p<0.01);mTOR蛋白表达量显著有所增加(p<0.01)。与DN组比较,保护组AMPK蛋白表达量显著减少明显(p<0.01);p-PI3K/PI3K蛋白表达量上调(p<0.01);p-Akt/Akt蛋白表达量显著上调(p<0.01);mTOR蛋白表达量显著下调(p<0.01)。说明DN小鼠的AMPK/PI3K/AKT/mTOR通路受到抑制,黄芪甲苷可以激活AMPK,促进PI3k磷酸化表达,活化AKT,mTOR表达减少,促进线粒体自噬发生。结果表明DN的发生与线粒体稳态平衡被打破有关,黄芪甲苷通过调节线粒体生物发生以及线粒体自噬起到相应的保护作用。