论文部分内容阅读
本课题主要研究:1、建立稳定的火药烟雾诱导的细胞炎症损伤体系。2、通过对火药烟雾诱导人支气管上皮细胞(BEAS-2B)产生炎症损伤的研究,揭示火药烟雾致BEAS-2B细胞合成、分泌炎症因子的机制。3、通过葛根素(puerarin)的干预研究揭示葛根素在火药烟雾诱导人支气管上皮细胞损伤中的防护作用,进而探讨葛根素的防护机制。根据前期研究基础建立稳定的火药烟雾诱导人支气管上皮细胞炎症损伤的体系,火药烟雾作用BEAS-2B细胞10min后将细胞继续放入培养箱中培养24h后于倒置显微镜下观察细胞状态。采用MILLIPLEX○RMAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel试剂盒通过Luminex200多功能流式点阵仪检测黑火药烟雾诱导上皮细胞产生的炎症因子。实验分组:对照组、烟熏组、烟熏+葛根素组(浓度为100μg/ml,烟雾作用前2h加入)。利用气体检测器实时监测火药烟雾中气体成分及含量的变化。采用CCK-8试剂盒在酶标仪上检测黑火药烟雾诱导BEAS-2B细胞损伤后细胞活性及不同剂量葛根素(25、50、100μg/ml)的防护作用。采用活性氧(ROS)检测试剂盒(DCFH-DA探针)通过流式细胞仪检测火药烟雾作用BEAS-2B细胞后细胞内ROS水平。应用ELISA方法定量检测火药烟雾作用BEAS-2B细胞后及葛根素干预后细胞因子IL-8的分泌变化,实验分组:对照组、烟熏组(烟雾作用10min后培养不同时间:0h、3h、6h、9h、12h、24h)、烟熏+葛根素组(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)、烟熏+NAC组(2mM、4mM、6mM、8mM、10mM)、烟熏+Bay11-7082抑制剂组(NF-κB的抑制剂,剂量为:1μM、2μM、4μM、8μM)、烟熏+SB203580抑制剂组(P38MAPK的抑制剂,剂量为:10μM)。利用蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测火药烟雾作用BEAS-2B细胞后磷酸化蛋白P38MAPK(P-P38MAPK)及磷酸化蛋白IκBα(P-IκBα)的水平情况。检测结果显示1、火药烟雾作用BEAS-2B细胞后观察到细胞变圆并且细胞与细胞之间变稀疏。2、通过细胞因子的检测,结果表明粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)四种有统计学意义(P<0.05),其中IL-8表达最稳定,加入葛根素干预后细胞因子的表达都相应降低。3、火药烟雾燃烧后氧气(O2)的含量逐渐降低;烟雾作用10min内H2S保持88.2ppm不变;CO的含量随着时间的延长逐渐升高。4、黑火药烟雾作用BEAS-2B细胞后细胞活力下降,加入葛根素干预后细胞活性明显提高。5、火药烟雾作用BEAS-2B细胞后细胞内活性氧(ROS)水平明显增加,随着葛根素干预剂量的增加,ROS水平呈剂量依赖性降低。6、检测细胞因子IL-8的结果表明:烟雾作用BEAS-2B细胞后随着培养时间的延长,IL-8分泌逐渐增加,在24h时表达最高;火药烟雾作用后BEAS-2B细胞后随着葛根素干预剂量、NAC浓度、Bay11-7082抑制剂浓度的增加,人支气管上皮细胞IL-8的分泌逐渐减少;加入SB203580抑制剂干预后,IL-8的分泌明显降低。7、火药烟雾作用BEAS-2B细胞10min后P-P38MAPK的水平明显升高,以后逐渐降低,而P-IκBα的水平在细胞继续培养2h时升至最高,烟雾作用BEAS-2B细胞前加入NAC及葛根素干预后P-P38MAPK及P-IκBα蛋白水平降低,同时加入SB203580及Bay11-7082抑制剂干预后P-P38MAPK及P-IκBα的水平也降低。综合以上研究结果表明:火药烟雾作用BEAS-2B细胞后引起多种细胞因子分泌增加,其中IL-8分泌最稳定,同时可引起细胞内ROS水平升高,加入NAC、SB203580及Bay11-7082抑制剂干预后IL-8分泌减少,P-P38MAPK及P-IκBα蛋白水平降低。火药烟雾诱导BEAS-2B细胞分泌IL-8增加的机制可能通过ROS-P38MAPK及下游NF-κB分子信号通路。同时葛根素对火药烟雾诱导BEAS-2B细胞炎症具有防护作用,防护作用的机制可能也是通过ROS-P38MAPK及下游NF-κB分子信号通路。