研究目的胞内ATP是机体生命活动的直接能量来源,生理条件下,胞内ATP有少量流出胞外,形成胞外ATP(extracellular adenosine triphosphate, eATP),后者受到ATP/ADP酶的严格调控,因而浓度维持在较低水平。尽管如此,微量的eATP作为机体重要的信号分子,可通过自分泌或旁分泌的方式作用于细胞膜表面的特异性嘌呤受体,从而参与嘌呤信号转导。该过程几乎存在于所有活细胞中,可调节细胞的多种生物学反应。在组织损伤、应对压力等病理条件下,细胞可以向胞外释放大量ATP。在肿瘤微环境中,肿瘤局部低氧缺血,坏死的组织细胞释放大量ATP进入细胞外基质,使局部微环境中ATP浓度急剧升高。大量报道表明,eATP与多种肿瘤的病理生理状况密切相关。但由于肿瘤的异质性以及eATP激活的受体不同,eATP对肿瘤的作用效应也截然不同。肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一类典型的上皮组织来源的恶性肿瘤,其转移率高,易复发,病死率极高,因此,阐明肝癌转移的机制并加以预防是控制肝癌进展、提高生存率的关键所在。肿瘤转移是一个多步骤过程,主要包括局部组织浸润、侵入血管、在脉管系统中转移、移出血管、在特定的组织定居并增殖等步骤。正常上皮细胞脱离细胞外基质附着后会诱发凋亡,即“失巢凋亡”；而恶性肿瘤细胞获得了抵抗失巢凋亡的能力,此类细胞发生上皮-间质细胞转化,进入脉管系统后能够以锚定非依赖性的方式存活,是肿瘤转移的重要前提。eATP对肝细胞肝癌是否具有一定效应及其作用机制至今仍不明确。本课题深入研究了eATP对锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞的调控效应,并初步探讨了其分子机制,证实高剂量eATP能够通过P2X7受体对靶细胞发挥细胞毒效应,并且为预防和控制肝癌的进展和转移提供了新的思路。材料和方法1.建立锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞模型为模拟肝癌细胞在体内原位生长以及脱离细胞外基质附着继续存活的状态,我们在体外分别建立了锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞模型。具体方法为：肝癌细胞接种于普通培养平板中,即为锚定依赖性模型。配制36mg/ml的2-羟乙基甲基丙烯酸脂(poly-HEMA),在培养板底部均匀铺平,覆盖整个板底,紫外线照射过夜。细胞在经过该种处理的培养板中生长即为锚定非依赖性模型。2.不同剂量eATP对锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞生长状态的影响2.1细胞以3×105的密度接种于普通培养板和poly-HEMA铺板的培养板中,以此构建肝癌细胞锚定依赖性和非依赖性的细胞模型。不同剂量eATP (OmM,0.05mM, O.1mM, lmM,2.5mM)刺激锚定依赖性和非依赖性的BEL7402肝癌细胞24h,镜下观察其形态学变化。2.2不同剂量eATP刺激锚定依赖性和非依赖性的BEL7402、SMMC7721以及HepG2肝癌细胞24h, CCK-8法检测eATP对细胞增殖活性的影响。2.3不同剂量eATP刺激锚定依赖性和非依赖性的BEL7402肝癌细胞24h, western blot检测细胞凋亡和自噬相关蛋白的表达情况以及胞内信号通路的变化。2.4高剂量eATP (2.5mM)刺激锚定依赖性和非依赖性的BEL7402肝癌细胞,并于作用后Oh,1h,3h,6h,9h,12h收集细胞,应用western blot检测细胞凋亡和自噬相关蛋白分子的表达情况以及胞内信号通路的变化。2.5自噬抑制剂3-MA预处理BEL7402肝癌细胞30min,加入1mM或2.5mM eATP作用24h后,应用CCK-8法和免疫荧光技术检测细胞自噬受抑制后eATP对肝癌细胞的细胞活力、凋亡、自噬水平等的作用效应。3.高剂量eATP对肝癌细胞的细胞毒效应3.1抗降解型BzATP替代eATP处理细胞24h, western blot检测处理前后肝癌细胞凋亡和自噬的情况以及胞内信号通路的变化.3.2eATP降解酶apyrase预处理锚定依赖性和非依赖性的BEL7402细胞,加入2.5mM eATP作用24h后,CCK-8法检测eATP处理前后肝癌细胞的存活细胞数,western blot检测凋亡和自噬标记物的活化,以及相应的信号通路变化。4.高剂量eATP诱导肝癌细胞凋亡,抑制自噬的作用效应与分子机制4.1P2X7受体抑制剂KN-62预处理锚定依赖性和非依赖性的BEL7402细胞,加入2.5mM eATP作用24h,CCK-8法检测eATP处理前后的存活细胞数,western blot检测凋亡和自噬标记物的活化,以及相应的信号通路变化。4.2AMPK通路的抑制剂compound C预处理肝癌细胞30min后,加入2.5mM eATP刺激细胞24h, western blot检测AMPK和mTOR信号通路的变化,以此明确eATP发挥效应是通过AMPK和mTOR两条独立信号通路还是AMPK/mTOR通路所介导。研究结果1.高剂量eATP能够有效诱导锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞凋亡,并抑制自噬发生1.1不同剂量eATP刺激锚定依赖性和非依赖性的BEL7402肝癌细胞,观察肝癌细胞的形态学变化以不同剂量eATP刺激锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞24h,镜下观察其形态学变化。当eATP剂量不超过1mM (0,0.05mM,0.1mM,1mM)时,细胞形态并无明显变化。当eATP剂量提高到2.5mM时,锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞形态均发生明显变化,细胞皱缩变圆,大量细胞死亡。1.2不同剂量eATP刺激锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞,CCK-8法检测其细胞活力以不同剂量eATP刺激锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞,结果显示,低剂量eATP刺激肝癌细胞,锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞均无明显的细胞活力变化,而2.5mM eATP处理细胞后,细胞活力明显降低。1.3高剂量eATP诱导Caspase-3活化,并抑制LC3-Ⅱ生成以不同剂量eATP作用于锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞,、Vestern blot结果显示,肝癌细胞受到低剂量eATP刺激后,Caspase通路无明显活化,LC3-Ⅱ水平较高。2.5mM eATP刺激后,Caspase-3活化明显增多,而LC3-Ⅱ的生成量明显降低,提示2.5mM eATP能够显著性诱导凋亡,抑制自噬。而进一步的信号通路检测显示,2.5mM eATP能够显著活化AMPK通路,抑制mTOR通路。1.4eATP对锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞的细胞毒效应具有时间依赖性以不同剂量eATP作用于锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞,并于不同时间点(Oh,1h,3h,6h,9h,12h)收集细胞进行Western blot检测。结果显示,随着时间的延长,AMPK信号通路和Caspase-3的活化逐渐增强,而mTOR通路和自噬标记物LC3-Ⅱ的水平逐渐减弱,说明eATP所引发的凋亡和自噬的反应,以及信号通路变化具有时间依赖性。1.5应用3-MA抑制自噬后,1mM eATP能够发挥显著的细胞毒效应3-MA预处理细胞30min后,以1mM eATP刺激BEL7402肝癌细胞24h,免疫荧光以及CCK-8法检测细胞自噬受抑制后细胞活力及凋亡率的变化。结果显示,在3-MA和1mM eATP的作用下,细胞活力明显降低,凋亡率显著升高。我们的结果显示,当自噬受到抑制后,1mM eATP能够发挥显著的细胞毒效应,说明自噬能够有效保护肝癌细胞抵抗1mM eATP诱导的细胞凋亡。2.高剂量eATP诱导锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞的细胞毒效应的进一步验证2.1BzATP对肝癌细胞凋亡和自噬的平衡起到与eATP相似的调控作用应用非降解型BzATP进一步验证eATP的作用效应。以1mM或2.5mM BzATP分别处理锚定依赖性和非依赖性BEL7402细胞,培养24h后应用western blot检测细胞凋亡和自噬的标记物的变化。结果显示,与eATP的作用相似,1mM BzATP对BEL7402细胞没有明显的细胞毒效应,而2.5mM BzATP则可以显著活化Caspase-3,抑制LC3-Ⅱ生成,同时胞内AMPK通路活化,mTOR通路受抑制。2.2eATP降解酶能够显著逆转eATP对肝癌细胞凋亡和自噬的调控作用应用eATP降解酶apyrase预处理锚定依赖性和非依赖性BEL7402肝癌细胞30min,再加入2.5mM eATP培养24h。CCK-8法和western blot对细胞活力、细胞凋亡和自噬的情况以及胞内信号通路的变化进行检测。结果发现,apyrase预处理能够逆转高剂量eATP诱导的细胞毒效应,信号通路也发生相应逆转。3.进一步明确高剂量eATP诱导锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞产生细胞毒效应的分子调控机制3.1P2X7受体抑制剂KN-62能够显著逆转eATP对肝癌细胞凋亡和自噬的调控作用应用P2X7受体拮抗剂KN-62预处理锚定依赖性和非依赖性的BEL7402肝癌细胞30min,再加入2.5mM eATP,培养24h. CCK-8法和western blot对细胞活力、细胞凋亡和自噬的情况以及胞内信号通路的变化进行检测。结果发现,加入KN-62能够有效逆转高剂量eATP诱导的细胞毒效应,信号通路也发生相应逆转。3.2高剂量eATP引发的细胞毒效应通过AMPK/mTOR通路介导应用(?)MPK通路抑制剂compound C预处理BEL7402细胞0.5h,再以2.5mM eATP处理细胞,培养24h。 Western blot结果显示,当AMPK通路被封闭后,2.5mMeATP无法激活该通路,而mTOR通路也相应活化,说明mTOR是AMPK的下游靶分子,受AMPK的负向调控。AMPK/mTOR通路介导高剂量eATP诱导的细胞毒效应。结论1.高剂量eATP作用下,锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞发生明显的形态学变化,细胞活力检测证实活细胞数显著降低,提示高剂量eATP能够有效诱导肝癌细胞死亡。2.锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞在高剂量eATP的作用下,均可激活Caspase通路,并抑制LC3-Ⅱ生成,提示高剂量eATP能够诱导肝癌细胞凋亡,而抑制细胞自噬。3.锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞在高剂量eATP的作用下,胞内AMPK通路被激活,而mTOR通路被抑制,结合compound C作用后的效应,提示AMPK/mTOR通路参与并介导高剂量eATP对肝癌细胞的细胞毒效应。4.肝癌细胞的自噬作用被抑制后,肝癌细胞对eATP诱导凋亡的敏感度增强。这进一步证明自噬在肝癌细胞抵抗eATP诱导的细胞毒效应中起到维持细胞生存的保护性作用。创新性及意义1.本课题首次研究了eATP对锚定依赖性和非依赖性肝癌细胞的效应,结果显示,两种类型的肝癌细胞对eATP的敏感度相同,因此eATP可以作为预防和控制肝癌转移的有效策略,加以深入研究。2.本课题首次探讨了在锚定依赖性和非依赖性的肝癌细胞中,eATP对细胞凋亡和自噬作用的调控效应。结果显示,肝癌细胞通过自噬逃逸低剂量eATP诱导的细胞毒效应。凋亡和自噬的平衡使肝癌细胞在eATP诱导的细胞毒效应中能够继续存活,而高剂量eATP作用下,自噬和凋亡平衡被打破后细胞趋于死亡。3.我们首次提出肝癌细胞中凋亡与自噬的平衡是由AMPK/mTOR信号通路所介导,这有助于人们更加深入理解eATP诱导的细胞毒效应的分子调控机制。研究目的肝细胞肝癌是全球范围内仅次于肺癌和胃癌的癌症第三大死因,其发生是一个多步骤多因素的过程,多是由病毒性肝炎经过肝硬化而最终形成的,因而与慢性炎症的关系极为密切。炎性体是存在于细胞胞浆中的一类多蛋白复合物,其活化能够介导炎症的发生。在目前发现的几类炎性体中,NLRP3(?)性体是研究最清楚的一种。NLRP3蛋白分子能够募集ASC、Caspase-1前体,形成炎性体分子复合体,最终导致促炎因子IL-1p和IL-18成熟分泌,从而介导炎症的发生。目前对于NLRP3炎性体活化机制及其效应的研究主要集中在固有免疫细胞中,其在肿瘤中的作用效应和机制尚不明确。本课题旨在阐明NLRP3炎性体在肝癌细胞中的表达情况及其在HCC发生发展过程中所发挥的效应。实验方法1.肝癌及癌旁组织中NLRP3炎性体组分的表达情况检测1.1取128例肝癌及癌旁组织芯片,分别对NLRP3, ASC, Caspase-1以及IL-1β等四个炎性体相关组分进行免疫组化染色,检测其在肝癌细胞中的表达水平。1.2用SPSS软件分析NLRP3, ASC, Caspase-1以及IL-1β四个分子在肝癌组织和癌旁组织中的表达强度差异,对各分子间的表达强度进行相关性分析,并分别分析各分子与临床资料的相关性。1.3在临床肝癌组织标本中,对NLRP3炎性体组分的mRNA表达水平的进行real-time PCR和RT-PCR检测,并进行统计学分析。1.4在临床肝癌组织标本中,对NLRP3炎性体组分的蛋白表达水平进行western blot检测。2.在肝癌细胞中进行重构NLRP3炎性体,探究炎性体对肝癌细胞生物学活性的影响2.1瞬时转染编码NLRP3炎性体各组分的表达质粒向SMMC7721和HepG2肝癌细胞系中共转染NLRP3, ASC, Caspase-1以及IL-1β4种炎性体组分,进行NLRP3炎性体的重构。各组分的用量分别为15ng pcDNA3-myc-NLRP3,5ng pcDNA3-myc-ASC,5ng pcDNA3-myc-pro-Caspase-1以及150ng pRC/cMV-proIL-1β RT-PCR和-(?)western blot等方法分别从mRNA水平和蛋白水平验证重构是否成功。2.2检测NLRP3炎性体对肝癌细胞增殖能力和克隆形成能力的影响分别向SMMC7721和HepG2肝癌细胞系中转染NLRP3炎性体真核表达质粒,通过CCK-8法、LDH释放实验和克隆形成实验检测NLRP3炎性体重构前后对肝癌细胞细胞活力、细胞毒性和克隆形成能力的影响。2.3检测NLRP3炎性体对肝癌细胞迁移能力的影响在SMMC7721和HepG2肝癌细胞系进行NLRP3炎性体的重构,划痕实验和transwell实验,检测NLRP3炎性体重构对肝癌细胞迁移能力和侵袭转移能力的影响。3. NLRP3炎性体对肝癌细胞作用效应的机制研究分别向SMMC7721和HepG2肝癌细胞系中共转染炎性体组分,进行NLRP3炎性体的重构,western blot检测NLRP3炎性体重构前后(?)nTOR、AKT、NF-kappaB、等信号通路的变化。研究结果1. NLRP3炎性体在肝癌组织中表达显著下调1.1免疫组化结果显示,与癌旁组织相比,NLRP3, ASC, Caspase-1和IL-1β四个炎性体组分在肝癌组织中的染色强度显著降低。1.2SPSS统计软件对免疫组化结果进行卡方检验,分析肝癌与癌旁组织中四个炎性体组分的阳性,结果具有显著的统计学差异(***P<0.001)。对四个炎性体组各分子间的相关性进行spearman秩相关检验,结果表明NLRP3炎性体组分之间的表达呈显著性正相关,提示炎性体组分以炎性体分子平台的形式共同发挥效应。对NLRP3, ASC, Caspase-1和IL-1β四个炎性体组分与临床资料之间进行spearman相关性分析,发现炎性体组分与性别、年龄、肿瘤大小等指标之间没有显著性相关关系,但是与病理分级、临床分期之间呈显著性负相关,其负相关关系具有显著性统计学意义(*P<0.05)。1.3对NLRP3表达变化趋势在临床新鲜肝癌组织和癌旁组织中进行了进一步的验证。分别抽提肝癌和相对应的癌旁组织中的总RNA和蛋白,应用RT-PCR, real-time PCR以及western blot等方法对NLRP3炎性体的表达水平进行检测。结果显示,与癌旁组织相比,肝癌组织中NLRP3, ASC, Caspase-1和IL-1β四个炎性体组分在(?)mRNA水平和蛋白水平的表达均显著下调(***P<0.001)。2. NLRP3炎性体重构对肝癌细胞生物学活性的影响2.1向SMMC7721和HepG2肝癌细胞系中共转染NLRP3, ASC, Caspase-1以及IL-1β4种炎性体组分,以此在肝癌细胞中进行炎性体的重构。经过RT-PCR和western blot验证,炎性体重构成功。2.2NLRP3炎性体抑制肝癌细胞的增殖能力和克隆形成能力在SMMC7721和HepG2肝癌细胞系中重构NLRP3炎性体,CCK-8法,LDH释放实验和克隆形成实验表明,在肝癌细胞进行炎性体重构后,肝癌细胞的增殖力,细胞活力和克隆形成能力均显著降低(*P<0.05,***P<0.001)。2.3NLRP3炎性体抑制肝癌细胞的迁移、运动能力在SMMC7721和HepG2肝癌细胞系中重构NLRP3炎性体,划痕试验和transwell实验表明,过表达NLRP3炎性体组分后,肝癌细胞迁移、运动力显著降低(*P<0.05,**P<0.01)。3.重构NLRP3炎性体,抑制mTOR信号通路活化,并激活ERK1/2信号通路。在SMMC7721和HepG2肝癌细胞系中重构炎性体,western blot检测结果显示,mTOR和S6K1磷酸化水平显著降低,而ERK1/2磷酸化水平显著增高(*P<0.05,**P<0.01),提示NLRP3炎性体可通过活化ERK1/2信号通路、抑制mTOR通路发挥效应。结论1.应用RT-PCR、real-time PCR、免疫组化和western blot等方法证实,在肝癌组织中NLRP3炎性体各组分在(?)(?)RNA和蛋白水平的表达均显著下调。进一步的统计学分析显示,NLRP3炎性体的表达水平与肝癌的病理分级和临床分期呈显著性负相关。2.在肝癌细胞中进行NLRP3炎性体重构,通过对肝癌细胞恶性行为的检测,发现NLRP3炎性体重构能够显著抑制肝癌细胞增殖力和迁移力,从而逆转其恶性行为。3. NLRP3炎性体通过负向调控肝癌细胞的mTOR信号通路并正向调控ERK1/2信号通路,影响肝癌细胞的生物学行为。创新点及意义1.对NLRP3炎性体的研究大多集中在固有免疫领域,其在肿瘤中的作用鲜有报道。本课题首次在肝细胞肝癌中研究了NLRP3炎性体的表达与功能,揭示了NLRP3炎性体在肝癌发生发展过程中的重要作用,为其在肿瘤免疫领域的进一步研究提供了新思路。2.本研究发现NLRP3炎性体在肝癌组织中的表达水平显著下调,并与肝癌的病理分级和临床分期负相关,提示NLRP3的表达下调参与了肝癌的疾病进展。在肝癌细胞中进行NLRP3炎性体的重构,能够显著逆转肝癌细胞的恶性行为,从而抑制肿瘤的发展进程。该研究结果证实,NLRP3炎性体的表达失调参与了肝癌的发生发展过程,为肝癌发生机制的阐明和早期干预措施的探索奠定了基础。