【摘 要】
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目的:白杨素（Chrysin,CHR）,蔓荆子黄素（Vitexicarpin,VIT）,刺芒柄花素（Formononetin,FOR）和北美圣草素（Eriodictyol,ERI）均是4种黄酮类中药单体,据报道它们具有抗氧化,抗肿瘤的作用,且生产成本低,易于降解。本研究从中筛选出了激活抗原提呈细胞（Antigen-presenting cells,APCs）功能最好的CHR,进一步以B16F10黑
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目的:白杨素（Chrysin,CHR）,蔓荆子黄素（Vitexicarpin,VIT）,刺芒柄花素（Formononetin,FOR）和北美圣草素（Eriodictyol,ERI）均是4种黄酮类中药单体,据报道它们具有抗氧化,抗肿瘤的作用,且生产成本低,易于降解。本研究从中筛选出了激活抗原提呈细胞（Antigen-presenting cells,APCs）功能最好的CHR,进一步以B16F10黑色素瘤荷瘤小鼠作为模型,评价CHR作为疫苗佐剂,在抗原刺激机体时,可以增强其免疫原性,增强CD8+T细胞的免疫功能,从而提高抗肿瘤免疫应答,并探索其免疫学作用机制。方法:CHR,VIT,FOR和ERI这4种中药单体分别设置了低、中、高3个浓度以及阴性对照和脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）阳性对照,在体外刺激RAW264.7细胞和DC2.4细胞48h,检测CD80,CD86,MHCI和MHCII的表达水平。为了确定CHR是否通过激活APCs发挥佐剂作用,分别进行了体外和体内的先天免疫实验。体外以工作浓度为10μg/ml的鸡卵白蛋白（Ovalbumin,OVA）为抗原肽,20μg/ml的CHR为佐剂,共同刺激RAW264.7细胞和DC2.4细胞48h,并测定4种表面标志物CD80,CD86,MHCI和MHCII的激活情况。体内以B16F10细胞中提取的可溶性蛋白为抗原,CHR为佐剂,第一次免疫小鼠后3天,检测小鼠脾细胞中CD11b+细胞和CD11c+细胞的CD80,CD86,MHCI,MHCII和TNF-ɑ表达水平以及DC细胞的分型变化。用CHR和OVA共同刺激RAW264.7细胞48h后,检测其细胞因子IL-12及IL-10的表达水平,继而通过发现IL-12上调后,检测IL-12下游脾细胞中STAT4和P-STAT4的变化,从而探索CHR的免疫学作用机制。为了检测佐剂对T细胞免疫的作用,分别于第0天和第14天免疫小鼠,第一次免疫后21天,取小鼠脾细胞制备成脾细胞悬液,检测CD4+T细胞和CD8+T细胞分泌的细胞因子。接下来,为了验证CHR是否可以作为预防性疫苗的佐剂,两次免疫后7天建立荷瘤小鼠模型,记录小鼠的生存曲线及肿瘤大小。最后,为了证明CD8+T细胞在抑制B16F10黑色素瘤生长过程中的关键作用,我们将二次免疫后7天小鼠的CD8+T细胞尾静脉回输到B16F10荷瘤小鼠体内,记录小鼠的生存曲线及肿瘤大小。结果:通过对比4种中药单体在体外作用于RAW264.7和DC2.4细胞后4种表面标志物的表达水平,发现CHR对APCs的免疫激活效果最佳,可以作为候选疫苗佐剂进行后续实验。在体外先天免疫实验中,CHR与OVA抗原肽共同刺激两种APC细胞系,可以显著上调其CD80,CD86,MHCI和MHCII 4种表面标志物的表达水平。在体内先天免疫实验中,CHR作为B16F10疫苗佐剂可以有效激活APCs,上调小鼠脾细胞中CD11b+细胞的CD80,CD86,MHCI和MHCII的表达水平和CD11c+细胞的CD86,MHCI,MHCII和TNF-ɑ的表达水平。CHR的免疫学作用方式可能是通过激活巨噬细胞分泌IL-12,从而上调其下游STAT4磷酸化水平来增强Th1细胞的功能,从而提高体内细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）的抗肿瘤效果。检测以CHR为佐剂对T细胞功能影响的实验结果表明,与单独B16F10抗原组比较,B16F10抗原+CHR组能够有效活化小鼠脾细胞中的CD4+T细胞分泌的干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）以及CD8+T细胞分泌的IFN-γ和肿瘤坏死因子-ɑ（TNF-ɑ）。另外,B16F10可溶性蛋白抗原联合CHR能够抑制小鼠模型中肿瘤的生长,小鼠的总体存活率高于单独接种B16F10抗原组。结论:综上所述,白杨素可以作为一种潜在的佐剂,通过IL-12-STAT4信号通路,提高抗原免疫原性,增强CD4+T和CD8+T细胞的免疫反应,抑制B16F10肿瘤的生长,提高机体对肿瘤的免疫应答。
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