烟草(Nicotiana tobacum)是一种经济作物，也是遗传转化的模式植物之一。1985年，Horsch等[3]人首创叶盘转化法，使得转化过程大为简化。此后，植物基因转化的研究得到迅速发展[4]。遗传转化的方法有很多种，其中根癌农杆菌介导法以其方法简单、效率高、拷贝数少等优点成为行之有效的方法之一[3]。本研究应用本实验室已克隆的一个新的糖苷转移酶基因[7]，将其插入载体pCAMBIA1301的多克隆位点(multiple clone site，MCS)处，得到一新的转化子。在烟草遗传转化过程中比较研究了各因素(如外植体的培养温度，预培养及共培养时间，农杆菌侵染时的O.D.600，抑制农杆菌生长的氨苄青霉素(Amp)使用的终浓度等)对根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法建立的糖苷转移酶基因烟草再生体系的影响，对各条件进行了详细的研究。其主要结果如下： 1.新的转化子转化根癌农杆菌用电转化法将新的转化子导入根癌农杆菌EHA105中，经卡那霉素(Kan)平板筛选阳性克隆，并用PCR扩增检测两种不同插入方向。证明新的转化子已导入EHA105中。 2.高效再生体系的建立经比较确定40－50天龄(>10叶)的烟草无菌苗取的叶盘(去掉主脉)为再生能力较强的外植体，以MS或1/2MS为基本培养基，从设计的一系列培养基中按效果筛选出MS+6-BA 2mg/L为预培养或共培养培养基；MS+6-BA 2mg/L+Kan 100 mg/L+Amp 600mg/L为选择培养基；1/2MS+Kan 50mg/L+Amp 400mg/L为生根培养基。 3.根癌农杆菌介导的烟草基因转化及转化的各条件研究在利用根癌农杆菌介导法进行烟草遗传转化的过程中，对外植体的培养温度，预培养及共培养时间，农杆菌侵染时的O.D.600，抑制农杆菌生长的氨苄青霉素使用的终浓度5个因素进行比较研究，分析这些因素对遗传转化的影响。结果表明，对外植体进行预培养是很有必要的，时间以3-5d为宜；共培养时间要视具体观察而定，一般以3-5d为佳；在25℃与28℃两种温度之间比较，28℃优于25℃，会使外植体较快分化，且分化频率要高；用于侵染的农杆菌菌液的O.D.600不能过高，否则经抗生素筛选培养一段时间后，仍能观察到潜伏农杆菌的生长，这会对叶片造成污染，致使叶片死亡，而O.D.600太低(如稀释为约0.3)，转化效率也会降低，多次检验后确定的最适浊度为0.5左右；在转化过程中，利用Amp抑制农杆菌生长，终浓度为600 mg/L。对这些影响转化的因素进行比较分析，旨在得到一个优化后的转化条件。 4.对转基因植株的检测与鉴定通过含一定浓度Kan的选择培养基对烟草外植体进行再生培养筛选，淘汰部分不具备Kan抗性的白化外植体。待得到抗性小苗后，移入生根培养基，同时取一小的叶片，用CTAB法[70]提取总DNA，与未经转化的烟草总DNA，进行特异性引物的扩增对照，引物一端为启动子区域上的序列，另一端为载体pCAMBIA1301的MCS处左右附近的序列。结果表明外源基因已整合入烟草基因组中。 5.转基因植株的表型特点得到的转基因小苗在转入生根培养基数周后(有继代)仍不能生根，重复实验得到了相同的结果(预计是否是因为糖苷转移酶基因的启动子区域整合入烟草基因组中后，产生的影响)。新的转化子中依然存在CaMV35S启动子，这是一个强启动子，转化的植株可能存在gus基因的高效表达。出现上述不能生根的现象是否是由于糖苷酶基因的导入或是由于gus基因的过量表达所致；或是由于生根培养基条件不合适所致，尚待进一步的研究。