论文部分内容阅读
G-四聚体DNA酶是由Hemin和富G单链DNA组成的复合物,其与辣根过氧化物酶（HRP）具有相似的催化活性,被广泛用于生物传感领域。例如,在化学发光传感中,其能催化H2O2氧化鲁米诺产生化学发光;在比色传感中,其能催化H2O2并将2,2’-联氮双（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）氧化成绿色的ABTS.+。众多研究学者将Hemin适配体序列切成两个片段,当目标DNA特异性识别探针DNA时,两个片段序列将组装成G-四聚体DNA酶。通过改变目标DNA识别区域的序列可以完成不同DNA的定量检测。该传感方法其显著的优点是无需标记、传感步骤极为简单,缺点是体系的空白高、信背比低,不利于低丰度DNA的检测。本论文研究的目的在于构建低空白信号、高信背比的DNA酶-SYBR Green I（SG）化学发光传感体系,并将其应用于无标记、高灵敏检测DNA。研究内容如下:1.构建了一种高信背比的DNA酶-SYBR Green I化学发光传感体系。实验发现DNA染料SG可显著提高DNA酶传感体系的信背比（4.20增至22.6）。为了探讨其机制,采用化学发光、荧光分光光度法、紫外-可见分光光度法等考察了体系化学发光动力学、不同染料对Hemin及DNA酶催化活性的影响、SG对不同化学发光体系的影响等。通过测定Hemin的米氏常数（Km）及最大反应速率(νmax)、SG与Hemin作用的荧光光谱图,含-SH和-NR基团化合物对Hemin化学发光的影响等,对SG抑制Hemin催化活性进行了解释;分别考察了SG嵌入dsDNA和Hemin嵌入G-四聚体后化学发光强度的变化,对DNA酶-SG信号恢复机理作出解释。结果表明SG对化学发光空白的抑制是由于SG中的含硫基团与Hemin中的辅因子Fe3+产生配位作用,导致其催化活性显著降低;当有目标DNA存在时,信号显著升高是由于形成的四聚体对Hemin的保护作用、SG嵌入dsDNA造成其浓度降低、DNA分子内的光催化作用等多方面因素引起的。2.将高信背比DNA酶-SG化学发光传感应用于p53基因的检测。考察了G3和G9探针浓度、Hemin浓度、SG浓度、DNA孵育温度、DNA孵育时间、SG孵育时间等实验条件对DNA酶-SG化学发光传感体系的影响。在最佳条件下,p53基因在5.0 pM-5.0 nM浓度范围内与体系信背比呈现良好的线性关系,最低检出限低至2.0 pM（3σ）。体系的重复性较好,RSD为3.0%,并且考察了体系对目标DNA和其它DNA的选择性,结果表明选择性较好。与其它核酸测定方法相比,该方法无标记和循环放大步骤、操作简单,检出限能与一些采用标记和放大的方法相当,有望用于实际样品的检测。