乳腺癌是当今女性最常见恶性肿瘤之一,世界范围内其发病率呈逐渐上升趋势。在我国,乳腺癌发病率已位居大城市女性恶性肿瘤的第一位。肿瘤患者死亡的重要原因是肿瘤细胞的扩散转移,而在肿瘤的扩散转移中,淋巴系统发挥着重要作用。因此研究肿瘤的淋巴道扩散机制对于了解肿瘤特别是实体瘤的转移具有重要的意义。既往由于缺乏明确的淋巴管生成因子和标记物,对于肿瘤淋巴道转移机制的研究相对滞后。近年来,随着一些特异作用于淋巴管内皮的生长因子及淋巴管内皮特异标志物的相继发现,使肿瘤淋巴管生成及其与淋巴道扩散转移关系的研究成为可能。其中D2-40是新近发现的一种淋巴管内皮细胞特异性标记物,能特异性地标淋巴管而不标记血管,可清晰地区分组织中的淋巴管和血管。血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor C, VEGF-C)和血管内皮生长因子-D(vascular endothelial growth factor D, VEGF-D)是血管内皮生长因子家族的两个新成员,被称为淋巴管生长因子,可分别结合血管内皮细胞表面受体VEGFR-2及淋巴管内皮细胞表面受体VEGFR-3,从而调节血管及淋巴管的生理功能。有研究表明,VEGF-C和VEGF-D能够刺激淋巴管内皮细胞增殖、迁移,诱导淋巴管生成。VEGF-C和VEGF-D在人类各种肿瘤生长和转移中的作用已经逐渐引起人们的重视。目前国内关于VEGF-C、VEGF-D在乳腺癌组织中的表达及其对淋巴管生成及淋巴转移的相互关系的研究较少。本研究通过免疫组化检测VEGF-C、VEGF-D及D2-40蛋白在乳腺癌组织及正常乳腺组织中的表达情况,计数D2-40阳性标记的微淋巴管数,得出微淋巴管密度(lymphatic microvessel density, LMD),以探讨VEGF-C、VEGF-D蛋白在乳腺癌淋巴管生成及淋巴道转移中所起的作用。目的研究血管内皮生长因子-C(VEGF-C)、血管内皮生长因子-D(VEGF-D)和D2-40在乳腺癌中的表达及其与临床病理因素的关系,并探讨VEGF-C、VEGF-D表达水平与淋巴管生成及淋巴结转移的关系。方法收集2008年6月至2009年9月期间于南方医院住院并经手术治疗的乳腺癌病例,从中选择临床资料和病理诊断资料完善的病例,项目包括：病案号、姓名、性别、年龄、种族、家庭地址、联系电话、肿瘤部位、象限、肿瘤大小、病理号、病理类型、组织分级、临床分期、淋巴结转移情况、ER, PR、HER-2免疫组化结果等。同时剔除术前曾接受放化疗或分子靶向治疗等辅助性治疗的病例,剔除乳腺癌复发病例,符合所有条件的病例共68例。从病理科获得选定的68例乳腺癌组织及距癌组织边缘5cm以上的正常乳腺组织的病理切片以及石蜡块,在光镜下观察切片,挑选形态上较典型的肿瘤切片及正常组织切片,然后取相应切片号的石蜡块,制作免疫组化用病理白片。采用Envision试剂盒行二步法免疫组化染色。石蜡切片脱蜡至水,柠檬酸缓冲液微波高档抗原修复25分钟,双蒸水冲洗3次,PBS冲洗3次,每次3分钟；过氧化氢酶阻断液微波低档孵育3分钟,清除内源性过氧化物酶活性,双蒸水冲洗3次,PBS冲洗3次,每次3分钟；滴加VEGF-C、VEGF-D或D2-40一抗,电热恒温培养箱37℃孵育1小时,PBS冲洗3次；滴加酶标羊抗鼠或兔IgG聚合物二抗试剂,培养箱中37℃孵育30分钟,PBS漂洗3次；室温下DAB试剂显色约5分钟(3-10分钟),自来水冲洗后苏木素轻度复染约1分钟,盐酸酒精分化约6秒,酒精脱水、二甲苯透明后中性树胶封固切片。染色可疑者即行重新标记染色。以PBS取代一抗作阴性对照,以已知阳性反应片作阳性对照。VEGF-C、VEGF-D免疫组化染色以细胞胞浆呈清晰棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达,其表达强度参照半定量积分法标准进行评分。D2-40免疫组化染色以胞浆和(或)胞膜呈清晰棕黄色或棕褐色颗粒为阳性表达,包括被染成棕黄色或棕褐色的微管、单个内皮细胞或细胞丛。凡单个孤立的或多个紧密排列的内皮细胞团,只要与邻近肿瘤细胞及周围结缔组织成分分界清楚,不论有无血管腔,即可计数为1个微淋巴管数。微淋巴管计数则参照Chalkley计数法,由两位事先不知道临床资料的病理医师在低倍光镜视野下扫视整个切片寻找3个染色阳性的脉管高密度集中的区域作为“热点”(hot spots),然后在200倍光镜视野下计数微脉管的数目,但应忽略管腔直径>8个红细胞或管壁有平滑肌存在的脉管,取3个视野的微脉管数的平均值作为该标本LMD。两位医师计数差异10%以上者重新计数。应用SPSS13.0软件对数据进行统计学处理。所有计量数据均以均数±标准差(x±s)表示,组间计量资料均数比较采用方差分析,方差齐性时应用ANOVA检验,方差不齐时应用Brown-Forsythe检验；计数资料比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman相关分析,相关系数用r表示。以P<0.05认为有统计学意义。结果1、VEGF-C在乳腺癌、正常乳腺组织中的阳性表达率分别为64.7%(44/68)、8.8%(6/68),其差异有统计学意义(χ2=45.671,P=0.000)；VEGF-D在乳腺癌、正常乳腺组织中的阳性表达率分别为58.8%(40/68)、5.9%(4/68),其差异有统计学意义(χ2=43.542,P=0.000)。2、VEGF-C阳性表达在淋巴结转移(χ2=9.555,P=0.023)和cTNM分期(χ2=10.757,P=0.005)的分组中,总体均数有显著性差异,表明淋巴结转移越多、临床分期越晚,VEGF-C的表达越强；而在肿瘤大小(χ2=3.780,P=0.151)、组织学分级(χ2=2.332,P=0.312)、ER(χ2=2.839,P=0.417)、PR(χ2=0.614,P=0.893)、Her-2 (χ2=3.401, P=0.334)分组中总体均数差异均无统计学意义。VEGF-D表达在淋巴结转移(χ2=9.719,P=0.021)和cTNM分期(χ2=9.905,P=0.007)的分组中,总体均数差异有显著性意义,表明淋巴结转移越多、临床分期越晚,VEGF-D的表达越强；而在肿瘤大小(χ2=2.294,P=0.318)、组织学分级(χ2=2.541,P=0.281、ER(χ2=0.849,P=0.838)、PR(χ2=3.283,P=0.350)、Her-2 (χ2=1.622, P=0.654)分组中差异均无统计学意义。3、68例乳腺癌组织中有62例出现了不同程度的D2-40表达,阳性率91.2%(62/68),染色内皮细胞胞膜和(或)胞浆呈棕黄色颗粒。对照组D2-40阳性表达率22.1%(15/68)明显低于乳腺癌组(χ2=66.129,P=0.000)。乳腺癌组织中D2-40阳性的微淋巴管密度为13.72±8.095个微淋巴管/200倍视野。LMD在肿瘤大小(F=26.779,P=0.000)、组织学分级(F=40.246, P=0.000)、cTNM分期(F=71.731,P=0.000)及淋巴结转移(F=39.727,P=0.000)分组中比较,差异均有统计学意义,而在ER(F=2.435,P=0.073)、PR(F=1.362,P=0.262)及Her-2(F=2.227,P=0.094)差异均无统计学意义。4、乳腺癌组织中VEGF-C阴性者的LMD均值为8.00±7229,VEGF-C阳性表达者(+、++、+++),其LMD均值分别为10.13±7.030、17.17±5.797、23.25±3.770,总体均数有显著性差异(F=13.672,P=0.000)；VEGF-D阴性者的LMD均值为9.14±8.049,VEGF-C阳性表达者(+、++、+++),其LMD均值分别为9.09±5.563、18.11±5.645、23.11±3.408,总体均数有显著性差异(F=14.446,P=0.000)。5、乳腺癌中VEGF-C的表达与LMD呈正相关(r=0.565,P<0.01),与淋巴结转移数目呈正相关(r=0.626,P<0.01)；VEGF-D的表达与LMD呈正相关(r=0.0.510,P<0.01),与淋巴结转移数目呈正相关(r=0.600,P<0.01)。结论1、VEGF-C、VEGF-D在乳腺癌组织中呈高表达并与淋巴结转移、临床分期相关,提示VEGF-C、VEGF-D在乳腺癌的发生发展中可能起重要作用。2、乳腺癌组织中微淋巴管主要分布于肿瘤边缘区,其LMD与肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移、临床分期有关,提示肿瘤边缘区LMD的增加可能与乳腺癌的侵袭及转移相关。3、VEGF-C、VEGF-D可能通过诱导癌周淋巴管的生成致LMD增加,从而促进癌细胞淋巴结转移。4、乳腺癌组织中的VEGF-C、VEGF-D及LMD联合检测可作为评估乳腺癌淋巴结转移的一项辅助指标,并为判断乳腺癌患者预后及确定临床治疗方案提供实验和理论依据。