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前言肿瘤的淋巴转移是恶性肿瘤转移的重要途径之一,也是影响患者预后至关重要的因素。研究表明,淋巴管生成在肿瘤的淋巴转移过程中可能起着不容忽视的作用。淋巴管内皮特异性标记物发现为研究淋巴管在肿瘤生物学中的作用提供了必要的条件。本研究联合测定胃癌以及良性病变组织中VEGFR-3的表达和淋巴管计数(LVD),探讨淋巴管计数与肿瘤部位、肿瘤大小和组织学类型、组织分化程度、组织学生长方式、大体类型、浸润深度、淋巴结转移等胃癌病理生物学行为以及病理分期、分型和淋巴结转移数、率的相互关系,为指导临床治疗、判断预后进一步奠定基础。方法一、实验材料(一)病例标本118例胃癌癌周石蜡标本取自中国医科大学附属第一医院肿瘤外科胃癌研究室(2005年6月～2006年10月的胃癌手术患者,均为首次手术,术前未接受肿瘤相关治疗)。其中男性79例,女性39例;年龄29～81岁。另取同期胃良性病变(慢性浅表性胃炎)活检标本20例作为对照组。所有标本经5μm厚连续切片,分别行苏木素—伊红及免疫组化染色。全部病例按UICC新TNM分期、日本胃癌处理规约及中国医科大学肿瘤研究所胃癌外科分型进行分期分型,以上病例均经病理证实。(二)实验用品1、主要试剂兔抗人VEGFR-3抗体(Rabbit anti-Flt4)和SABC免疫组化试剂盒:均购于武汉博士德公司。二甲苯溶液、乙醇、蒸馏水、0.01mmolPBS溶液、3%双氧水、柠檬酸缓冲液、DAB显色剂等,均由胃癌研究室提供。2、主要仪器切片机,显微镜,保湿盒,冰箱,恒温箱、高压锅,PH试纸。二、实验方法(一)组织切片染色采用免疫组化SABC法,对切片进行兔抗人VEGFR-3抗体染色,抗体稀释倍数为1:150,具体步骤按试剂盒说明书逐步操作。每批染色均用购买已知阳性对照片作阳性对照,并以PBS溶液代替一抗进行阴性对照。(二)结果判定VEGFR-3阳性淋巴管结果判断及计数方法:淋巴管内皮细胞VEGFR-3染色阳性为棕黄色,呈隙状、环形或条索状,内无红细胞,无肌性或纤维性管壁、可有内皮细胞。淋巴管密度计数采用Wendner等的方法,计数标准:在低倍镜下(100×)全面观察切片,选择癌间质、尤其是浸润边缘区域VEGFR-3阳性密集区(hot spot,热区),再在“热区”中选择4个高倍视野(400×)下计数淋巴管数取平均值。管腔明显管壁完整不论有无内皮细胞、单个着色的内皮细胞或独立于其他脉管的成簇内皮细胞均计数为一个淋巴管。选择淋巴管数量最多的区域计数并记录,取其平均值作为该病例的淋巴管密度(LVD)用于统计学分析。(三)统计学处理采用SPSS13.0统计分析软件进行统计学处理,根据不同的数据类型选择不同的统计方法:计量资料用均数±标准差(Mean±SD)表示,采用独立样本t检验或方差分析(SNK-q检验)分析淋巴管密度与各临床病理因素间的关系。准α=0.05,P＜0.05为有显著差异。结果一、镜下观察胃癌淋巴管的结构特点及染色情况镜下观察淋巴管的组织形态学结构特点:管壁薄,管径为毛细血管的3倍,且形态不规则。内皮细胞间连接不紧密通常呈层叠状,基底膜不完整或缺失。管腔内无红细胞。胃良性病变组织淋巴管形态正常,分布于粘膜、粘膜下层、肌层和外膜中,淋巴管数目较少。淋巴管的染色情况:淋巴管内皮染色呈棕黄色呈环形或条索裂隙状,部分胃癌细胞VEGFR-3染色阳性呈棕黄色。可结合淋巴管及淋巴管内皮细胞的结构特点及染色情况进行淋巴管计数。二、胃癌癌周组织LVD与胃良性病变组织的LVD的比较胃癌癌周组织LVD为(11.30±2.78)个/HP×400,明显高于胃良性病变组织的LVD(5.39±0.92)个/HP×400,两组之间的差异具有统计学意义(P=0.000)。三、早期胃癌癌周组织LVD与胃良性病变组织的LVD的比较早期胃癌癌周组织LVD为(6.77±0.60)个/HP×400,胃良性病变组织的LVD(5.39±0.92)个/HP×400,两组之间的差异无统计学意义(P=0.797)。四、胃癌癌周LVD与胃癌病理生物学行为的关系胃癌癌周淋巴管密度与胃癌癌灶大小(P=0.000)、大体分型(P=0.000)、临床TNM分期(P=0.000)、浸润深度(P=0.000)、淋巴结转移(P=0.000)有显著的相关性,胃癌癌周淋巴管密度与年龄(P=0.754)、性别(P=0.469)、分化程度(P=0.738)、生长方式(P=0.606)无明显相关性。五、胃癌癌周LVD与淋巴结转移数、率的关系胃癌癌周淋巴管密度与淋巴结转移率(rN)分级(P＜0.05)和淋巴结转移数分级(pN)(P＜0.05)呈正相关;结论1、胃癌癌周组织LVD明显高于胃良性病变组织的LVD,表明胃组织LVD与胃组织的良恶性有密切关系。2、早期胃癌癌周组织LVD与胃良性病变组织的LVD无明显差别,表明早期胃癌癌周组织中尚未出现明显的淋巴管增生,或增生的淋巴管较少。3、胃癌癌周组织LVD与胃癌的病理生物学行为关系密切,在一定程度上可以反映胃癌的性质、恶性程度及淋巴结的转移情况。4、胃癌癌周组织LVD同淋巴结转移数、率正相关,可以反映出发生胃癌淋巴结转移的程度。