脂肪酶(Lipase, EC3.1.1.3)是一类重要的甘油酯键水解酶,广泛存在于动物、植物及微生物中,可以在油水界面上催化脂类物质分解、合成和酯交换等反应,是最早研究的酶类之一。微生物脂肪酶具有种类多、比动植物脂肪酶具有更广的作用pH值和作用温度范围、便于进行工业生产和获取高纯度制剂等优点而在多个行业得到广泛应用。不同种属的微生物所产生的脂肪酶具有不同的催化特性,因此人们致力于发现具有不同优良特性的脂肪酶产生菌以满足不同的工业生产需求。脂肪酶的位置非特异性可以提高水解及转酯等反应的效率,适用于生物柴油生产、洗涤添加剂等领域。另外具有高活力是脂肪酶应用的首要前提。本文旨在通过从自然界筛选以及建立基因工程菌等手段获得具有多种优良性状的脂肪酶产生菌,为位置非特异性脂肪酶的应用奠定基础。本研究主要内容包括以下几部分：1.从油脂污染的土壤中筛选高产脂肪酶的菌株。利用以橄榄油为唯一碳源的平板进行初筛,再用罗丹明B平板及吐温-80平板进行复筛。从复筛平板上得到40株脂肪酶活力较高的菌株,对其进行液体培养检测产酶能力,并用薄层层析法检验所产脂肪酶水解底物的位置选择性。最后得到一株活力高(76 u/mL)、具有位置非特异性的脂肪酶产生菌,命名为S31。经表型、生理生化及16S rRNA序列鉴定,确定其为Burkholderia cepacia(洋葱伯克霍尔德氏菌)。2.对S31菌株发酵的培养基及培养条件进行优化组合。通过单因子实验和正交实验考查了影响产酶的内外部因素,确定S31产脂肪酶的最优条件为：以2%麸皮、1%蛋白胨、0.05%MgSO4、4% Tween-80和0.2% K2HP04为培养基(pH 7),250 mL三角瓶装40mL培养基,3%接种量,30℃,180 rpm培养66 h,酶活达283.6 u/mL。3.从S31发酵液中分离出电泳纯的脂肪酶,并研究其催化特性及稳定性。通过硫酸铵沉淀、离子交换和凝聚过滤实验,从S31发酵液中分离出一条约35 kDa、具有脂肪酶活力的蛋白条带。纯化倍数为19.8,回收率为13.3%。S31脂肪酶最适温度为65-70℃,同时该酶在高温下也相当稳定：55℃处理12 h后残留85%的酶活,70℃温育1 h后保留80%的活性。S31脂肪酶最适pH为9,在pH 7-10之间保持较高的活性,且对酸碱具有较好的耐性,在pH 5-9的缓冲液中处理12 h后能保留80%以上的活性。Ca2+、Mn2+、K+、Na+和Mg2+对S31脂肪酶具有激活作用,而Fe2+、Cu2+对酶活有抑制作用。S31脂肪酶在常见的有机溶剂,如甲醇、甘油、正己烷、正丁醇、甲苯和乙酸乙酯中都具有很好的稳定性,其中乙酯、正丁醇和正己烷能提高酶的活性。通过脂肪酶对不同脂肪酸酯的催化结果显示,S31脂肪酶具有较为广泛的底物范围,其中对中链脂肪酸酯的催化效率最高。4.通过PCR方法扩增了B. cepacia S31脂肪酶基因,并将其转化到枯草杆菌中进行外源表达。S31脂肪酶基因lipA包含1095个碱基,编码364个氨基酸。其下游基因lipB包含1035个碱基,编码344个氨基酸,两基因间隔3个碱基。LipB是脂肪酶LipA正确折叠分泌必不可缺少的分子伴侣。lipA基因5’端含有120个编码脂肪酶信号肽的碱基序列。基因在GenBank上的登录号为FJ638612。以pHT43为载体,将S31脂肪酶基因(lipA及lipB)导入枯草杆菌DB104内,在IPTG诱导下实现了分泌表达。在添加0.5%TritonⅩ-100的MSR培养基中诱导54 h后,酶活达到135 U/mL。同时对宿主DB104电击转化的条件进行了改良。在电击缓冲液中添加0.5 M海藻糖,并在菌体培养至OD1.0-1.2时制作感受态细胞,可以使转化率较改良前提高10倍。5.对Proteus vulgaris脂肪酶基因进行克隆和外源表达。P. vulgaris(普通变形杆菌)T6是本实验室筛选保存的另一个产脂肪酶的菌株,所产脂肪酶具有位置非特异性,对长链脂肪酸酯具有较好的亲和性。本实验将T6脂肪酶基因(PVL)与pET-DsbA载体连接,转化到大肠杆菌BL21(DE3)内表达,成功获得了重组脂肪酶,并对表达条件进行了优化。pET-DsbA-PVL在BL21内诱导表达的最佳条件为：以添加15 mg/mL葡萄糖和200μg/mL Amp的LB (pH 8.5)作为培养基,菌体浓度培养至OD600为1.2时,加入100μg/mL IPTG、15℃诱导15 h时,最高酶活达到192.2 U/mL。对重组菌BL21 [pET-DsbA-PVL]表达产物进行亲和层析纯化,得到电泳纯的普通变形杆菌脂肪酶蛋白(PVL),分子量约为31 kDa。外源表达脂肪酶的性质与野生酶性质相似。6.构建了组成型表达载体pMMP43。对枯草杆菌载体pMM1525进行改造,将其木糖诱导型启动子替换成枯草高效组成型启动子P43,得到载体pMMP43。将PVL基因连接到pMMP43内,在枯草杆菌WB800中获得了分泌表达。pMMP43-PVL在WB800内表达,培养48 h酶活达到60 U/mL。还将PVL基因插入到本室构建的另一表达载体pHPQ内,在WB800内实现了高效表达,诱导72 h时,酶活达到200 u/mL。