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背景目的:神经胶质瘤是神经系统最常见的恶性肿瘤,具有生长迅速、浸润性生长、恶性程度高、病程短、手术后易复发、预后很差等特点,严重威胁着人民群众的健康。神经胶质瘤发生的原因以及发生发展的机制还有很多待研究之处。肿瘤的发生发展与基因改变密切相关,而且存在一个基因改变和病变效应的不断积累、演化的过程。而基因改变中,癌基因和肿瘤抑制基因发挥的作用最为关键。肿瘤细胞中癌基因可以通过多种方式异常激活,同样,抑癌基因也可以通过多种方式异常失活。同时,不同个体肿瘤又在基因改变、药物敏感性上具有很大差异。抑癌基因TP53的表达产物p53蛋白在细胞周期的调控、细胞基因组完整性的维持、诱发细胞分化和凋亡中起着重要的作用。p53信号通路在肿瘤发生发展中发挥着相当重要的作用。P53信号通路在神经胶质瘤发生发展中也扮演着极其关键的作用。MDM2对p53蛋白水平具有重要的调控作用,而且这种调控作用与TP53基因状态密切相关,因此,本研究着重探讨MDM2特异性小分子抑制剂Nutlin-3对具有不同TP53基因状态的神经胶质瘤的作用和机制,为Nutlin-3的临床应用以及神经胶质瘤的个体化治疗提供实验依据。实验方法:采用RT-PCR方法克隆出神经胶质瘤细胞系U87、A172和U251中TP53基因转录出的cDNA,采用DNA测序方法确定其基因是否有改变。在此基础上,应用Nutlin-3处理三种细胞,使用MTT方法测定细胞活力,明确Nutlin-3对三种细胞作用的差异;采用MTT法检测Nutlin-3联合PI3K抑制剂LY294002应用对三种胶质瘤的作用。应用RT-PCR定量方法确定三种细胞用药前后p53以及p53靶基因MDM2、BAX和P21 mRNA表达量的差异,应用Western-blot方法检测p53蛋白、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)和核增殖抗原(PCNA)用药前后量的变化,应用Oligonucleotide pull-down方法检测三种细胞中p53蛋白的DNA结合活性。实验结果:1、克隆到的TP53基因cDNA片段经测序后确定,神经胶质瘤细胞系U87中TP53基因没有突变,属于野生型;而A172细胞系发生N239S改变,U251细胞系发生R273H改变。2、MTT细胞活力测定实验显示:MDM2抑制剂Nutlin-3能够明显抑制神经胶质瘤细胞U87(25μM,抑制率为36.97%)、A172(25μM,61.41%)的生长,而对U251(25μM,﹣18.27%)细胞没有明显作用;PI3K抑制剂LY294002对三种胶质瘤细胞在较高浓度下均有作用;Nutlin-3联合LY294002处理,抑制神经胶质瘤细胞生长作用明显强于单独使用Nutlin-3或LY294002。3、RT-PCR半定量实验显示:使用Nutlin-3处理前后,神经胶质瘤U251细胞p53 mRNA表达水平没有明显变化,而处理后U87、A172细胞中p53 mRNA表达水平显著升高(p<0.01);用药处理前后,U251细胞中p53靶基因P21和BAX mRNA表达水平没有太大变化,MDM2基因mRNA表达水平略有升高,但没有统计学意义。而处理后U87细胞中p53靶基因MDM2,P21和BAX mRNA表达水平明显升高(p<0.05);A172细胞中p53靶基因MDM2,P21 mRNA表达水平显著升高(p<0.01),BAX mRNA表达水平明显升高(p<0.05)。4、Western-blot实验表明:无药物处理时,神经胶质瘤U251细胞中p53蛋白水平显著高于U87和A172细胞(p<0.01);Nutlin-3处理后,U251细胞中p53蛋白水平略有提高但没有统计学意义。而用药处理后U87、A172细胞中p53蛋白水平显著升高(p<0.01),A172细胞升高尤其显著;药物处理后,细胞凋亡标志蛋白PARP在U87和U251细胞中没有明显变化,而在A172细胞中检测到少量caspase切割后片段;细胞增殖标志蛋白PCNA在U251和A172细胞中的水平没有明显变化,而在U87细胞中显著降低(p<0.01)。5、Oligonucleotide pull-down实验显示:U87细胞中野生型p53能够结合特定DNA序列,而且A172细胞中N239S改变型p53蛋白亦具备结合活性,只有U251细胞中R273H突变型p53蛋白不具备DNA结合活性。结论:1、神经胶质瘤细胞TP53基因状态不同,MDM2特异性小分子抑制剂Nutlin-3的作用有明显差别,提示临床治疗依据TP53基因状态决定MDM2抑制剂使用的必要性。2、PI3K抑制剂在较大浓度下对三种神经胶质瘤均有一定作用,MDM2抑制剂联合PI3K抑制剂的作用明显增加。3、A172细胞中TP53基因的改变不影响MDM2抑制剂的作用,说明该改变并没有改变p53蛋白的功能,Oligonucleotide pull-down实验进一步支持该结论。4、MDM2抑制剂通过抑制神经胶质瘤细胞增殖(PCNA改变)、促进神经胶质瘤细胞凋亡(BAX改变及PARP变化)发挥作用。5、MDM2抑制剂处理减少p53降解,p53蛋白水平增加导致靶基因表达水平增加,增加的MDM2会消掉MDM2抑制剂的部分作用,而增加的P21会进一步抑制MDM2的作用,提示p53-MDM2反馈调控环在肿瘤治疗中的重要性。