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化学疗法是目前治疗恶性肿瘤的主要手段之一，但是许多肿瘤的化疗效果不够理想，其主要原因是肿瘤细胞对化疗药物产生了耐药。神经胶质瘤是主要的原发性脑部肿瘤，占到了中枢神经系统肿瘤的40％。洛莫司汀(Lomustine，CCNU)是目前临床上治疗脑部肿瘤的一线用药，也用于直肠癌、乳腺癌等实体瘤的联合治疗，但其临床有效率不甚理想。已有研究显示，其耐药性的产生涉及甲基鸟嘌呤甲基转移酶的表达及核苷酸切除修复。 一氧化氮(Nitric oxide，NO)在体内的许多生理和病理的过程中都起了重要作用，体内外实验都证实NO有较强的杀肿瘤活性。在许多肿瘤组织中诱生型一氧化氮合酶(iNOS)呈高表达，许多细胞因子(如α-IFN、IL-1)能够刺激机体产生NO并维持高浓度NO的稳定。已有研究显示这些细胞因子能够对一些抗肿瘤药物的疗效产生影响。这样，NO就有可能在细胞水平上影响这些抗肿瘤药物的细胞毒作用，但对此尚未有足够的研究。 本实验通过观察在内源性或外源性NO存在的条件下，CCNU对BT-325胶质瘤细胞的细胞毒作用的变化，以此探讨NO对CCNU治疗肿瘤疗效的影响及其可能的相关机制。 浙江大学硕士学位论文实验方法1．实验细胞的准备 生长良好、尚末完全汇合的 BT325细胞消化后，以约 2．OX 10‘个圩接种于96孔培养板中，放入37oC、5％COZ的细胞培养箱培养12小时，贴壁后小心弃去旧培养基，每孔加 200ill含 10％FCS的 yMIq 培养基，以备实验使用。同一次实验使用同一次准备的细胞，每组实验设3个复孔。2．细胞因于对CCNU细胞毒作用的影响 ①20ng／ml的几1 J 的 LPS分别或联合作用 BT325细胞后，用 Gness反应检测12、24、36、48小时后生成的NO水平。②先用上述浓度的细胞因子处理12小时，再加终浓度为50mg／L的CCNU作用48小时，设相应对照组，检测各孔细胞生存率。③用0二stnmoffe的Nj基1－精氨酸甲酯（LNAME）与细胞因子同时预作用接种细胞，重复实验②。3．NO对CCNU细胞毒作用的影响 ①DETANONOate 0刀3、0刀5、0．1、0二mmol几分别和终浓度为 50mg／L的 CCNU同时作用于接种细胞，设相应对照组，48小时后检测各孔细胞生存率。②用DETANONOate的降解产物代替新鲜的DETA NONOate溶液，重复上述实验。③先用新鲜 DETA NONOate单独处理细胞，24小时后弃去旧培养基，用 PBS清洗后加终浓度为 50mg／L的 CCNU，作用 24小时后检测各孔细胞生存率。4．NO供体对CCNU药物本身的作用 将新鲜的 SNAP（0刀．05、0．l刀．2mof几）溶于含 100mg／L CCNU的 yMI二640培养基，置于4oC冰箱中24小时，然后将此混合培养基作用于接种细胞，每孔200…。不含SNAP的作为对照组。培养24小时后检测各孔细胞生存率。用SNAP的降解产物按上述步骤重复实验。s．中数效应分析（Median《ffect analysis） 分别求 CCNU和 DETA NONOate单独作用 24、48 ’J’时的剂量－效应曲线、中数效应方程，并计算r。值。 将 CCNU和 DETA NONOate按各自的 IC。。值之比混合后作用于培养细胞 24、 ．2． 浙江大学硕士学位论文48小时，求混合药物的剂量－效应曲线、中数效应方程。 用中数效应分析计算当细胞生长抑制率为 10％、30％、50％、70％和 90％时的 CI（COObioatiOO IOdCX）值。当 CI＜ l，认为药物间有协同作用；CI二 l，认为药物间有相加作用；0＞1，认为药物间有桔抗作用。Q值的大小一定程度上反映了相互作用的强弱。结果1．标准浓度亚硝酸钠的Gness反应标准方程为： C（pOOI／L二 150．3617A十0．1425（0＜A＜1＊6）r＝0．99812．细胞因子对CCNU细胞毒作用的影响 20n咖1的IL上 能刺激BT325细胞生成NO增加，并且作用12 ’J’时后NO浓度保持在一个较高的稳定水平。合用 20ng／ffil ILJ 和 10mg／L LPS后，刺激细胞生成＊O的能力大大增强（P＜0刀1）。联用卜＊＊＊E后，其刺激NO生成的能力被抑制。 用细胞因子处理 12小时后，再用终浓度为 50mg／L的 CCNU作用 48小时，结果显示：与不用细胞因子预处理的对照组比较，实验组的细胞生存率明显高于对照组（P＜0刀1）。联用卜＊＊＊E后，两组的细胞生存率无明显差别（尸卜0刀5）。3．NO对CCNU细胞毒作用的影响 加有DETA NONOate的各实验组细胞生存率都明显高于对照组（P＜0刀1），其效果在一定程度内随着 NO浓度的增加而增加。先用 DETA NONOate预处理，再用 50mg／L的CCNU作用细胞，其实验结果与两者同时作用基本一致。DETANONOate的降解产物与CCNU同时作用后，发现实验组与对照组无明显差别 （NO刀5）。4．NO与CCNU的相互作用 结果显示：与新鲜SNAP共培养后的CCNU组的细胞生存率明显低于对照组 （P＜0刀1人 而与S＊＊P降解产物共培养组的细胞生存率与对照组比较无明显差