胆汁酸是动物胆汁的重要成分,在脂质代谢中起着重要作用。同时,胆汁酸也可以作为一种代谢信号分子,参与机体糖代谢、内分泌代谢、能量平衡以及免疫反应的调节等,与代谢综合症、肿瘤、炎症、胆汁淤积、肠道微生态和动脉粥样硬化等的发生密切相关。胆汁酸是中药牛黄的主要功效成分之一,天然牛黄资源稀缺,价格昂贵;而人工牛黄是依照天然牛黄的主要成分由人工配制的一种牛黄代用品,在一定程度上满足了人们的用药需求。其中,胆汁酸主要通过从动物的胆汁中提取来获得,此过程工艺路线繁琐,会对动物造成伤害。而利用微生物细胞工厂生产胆汁酸是一种绿色经济的方法。酿酒酵母因具有遗传操作简单、生物安全和可利用廉价碳源等优势而成为一种常用的宿主细胞。胆固醇可经过一系列的酶促反应形成胆汁酸,构建可以从头生物合成胆固醇的酵母细胞是实现胆汁酸人工生物合成的前提。胆固醇在酿酒酵母中的合成以酵母甾醇为前体,酵母甾醇是酵母的内源性甾醇,也是酵母合成自身主要甾醇麦角固醇的前体。麦角固醇不但参与细胞膜的多种生物学功能,是细胞内多种生物学过程的重要调控因子,还是维生素D2以及甾体激素类药物的主要原料,可用于氢化可的松和黄体酮等药物的生产,具有重要的经济价值以及应用前景。因此,提高酿酒酵母的麦角固醇产量具有重要意义。本研究以酿酒酵母为底盘细胞,利用同源重组这种重组效率高且稳定性强的方法构建可以生物合成胆固醇的人工生物合成细胞,以期为接下来构建生物合成胆汁酸的重组菌株奠定基础。同时,本课题对实验室现有的一株酿酒酵母菌株进行了生产麦角固醇的发酵条件的优化,以提高麦角固醇的产量。具体研究内容和结果如下:1.生物合成胆固醇的酵母重组菌株构建为了在酿酒酵母中实现胆固醇的生物合成,通过同源重组在酵母细胞内引入胆固醇的生物合成途径。首先,经过数据库搜索和文献调研确定了编码甾醇C-7还原酶和甾醇C-24还原酶的外源基因,分别是褐家鼠源的DHCR7和人源的DHCR24。随后,采用同源重组的方法将酵母筛选标签URA3、外源基因DHCR7和DHCR24同时导入BY4741中以构建重组菌株,发酵后提取产物进行检测分析,未在重组菌株的发酵产物中检测到目标产物胆固醇。推测其原因是酵母中内源的麦角固醇途径与构建的胆固醇合成途径之间存在着竞争关系,且DHCR7和DHCR24两个关键酶在酿酒酵母中的表达水平不高,导致流向胆固醇的代谢流过低。2.酵母内源麦角固醇途径的阻断为了提高胆固醇的产量,本实验中我们敲除了麦角固醇合成途径中ERG5基因和ERG6基因,以促使碳通量更多地流向胆固醇的生物合成路径中。敲除ERG6后,在发酵产物中检测到了目标产物胆固醇。敲除ERG6的突变株较野生型而言,生长趋势无显著变化,说明ERG6的敲除不影响酵母菌株的生长发育。3.酵母生产麦角固醇发酵条件的优化本实验以实验室现有的一株酿酒酵母菌株CEN-1为研究对象,对其生产麦角固醇的摇瓶发酵条件进行了优化,如培养基中葡萄糖浓度、蛋白胨浓度、酵母提取物浓度、发酵初始p H和发酵时间等,提高了麦角固醇的产量。结论:1.通过同源重组在酿酒酵母BY4741的YPRCΔ15位点整合了编码甾醇C-7还原酶的DHCR7（褐家鼠源）和编码甾醇C-24还原酶的DHCR24（人源）,以URA3为筛选标签。构建了重组菌株Y-BY-0,未在其发酵产物中检测到胆固醇。2.在酿酒酵母BY4741的ERG6位点整合了DHCR7和DHCR24,以URA3为筛选标签。构建了可生产胆固醇的重组菌株Y-BY-1,当发酵时间为96 h时,重组菌株YBY-1的胆固醇产量最高,为0.81 mg/L。3.对酵母菌株CEN-1生产麦角固醇的发酵条件进行了探究,发现最佳发酵条件为:发酵培养基中葡萄糖浓为7.5 g/L,蛋白胨浓度为15 g/L,酵母提取物浓度为20 g/L,发酵初始为p H为6.5,最佳发酵时间为3天。菌株CEN-1在最优发酵条件下的麦角固醇产量为30.76 mg/L。