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作为世界上最重要的粮食作物之一，水稻生产关系到我国乃至世界的粮食安全。随着人口增长、全球气候变暖、耕地面积和水资源减少，我国水稻生产面临着巨大挑战。以CRISPR/Cas系统为代表的基因编辑技术可对靶标基因进行定点敲除、插入、替换等。大多数农作物优异等位基因差异主要是少数几个碱基或小片段插入/缺失引起，通过基因编辑介导的同源重组技术，可快速实现优异等位基因精准替换，大大缩短育种周期。但由于同源重组发生概率极低，特别是植物细胞含有细胞壁，无法将足量的修复模板递送到细胞中，CRISPR/Cas介导的等位基因替换效率偏低，成功报道较少，已成为利用基因编辑进行农作物等位基因替换的技术瓶颈和该领域的研究热点及竞争焦点。CRISPR/Cas12a(Cpf1)属于Ⅱ类type V CRISPR系统，具有组装简单、脱靶效率低等优点，但识别的5’-TTTV-3’PAM限制了CRISPR/Cas12a的应用范围。此外，CRISPR/Cas12a产生的交错切割可能会促进同源重组的发生，但在植物中尚未有利用CRISPR/Cas12a进行等位基因替换的报道。本论文从以下几方面进行了研究，并取得如下进展：
1)构建了CRISPR/Cas12a介导的水稻基因编辑体系，并扩展CRISPR/Cas12a系统在水稻中的应用范围：利用LbCas12a的G532R/K595R突变体LbCas12a(RR)和G532R/K538V/Y542R突变体LbCas12a(RVR)，以水稻OsPDS和OsSBEIIb为靶标基因，检测突变体的编辑效果。结果表明，在水稻中，LbCas12a(RR)可通过识别5’-TYCV-3’PAM(其中Y=T\C；V=A\G\C)的PAM实现多基因和多位点编辑，拓展了LbCas12a在水稻中编辑范围，编辑效率最高达51%，对于推进CRISPR/Cas12a在植物基因编辑研究领域的应用具有重要意义。
2)CRISPR/Cas12a系统介导的以DNA为修复模板的水稻定点基因片段替换：以水稻ALS基因为靶基因，双链DNA为同源重组修复模板，通过载体和修复模板共转化，实现了水稻中ALS基因的片段替换，创制出抗除草剂水稻新种质。同时，当只有左侧同源臂时，仍然可实现同源重组。初步明确了当有修复模板存在时，CRISPR/Cas12a介导的DNA双链断裂修复主要遵循合成依赖修复机制。本研究结果简化了修复模板的设计，可促进利用基因编辑介导的同源重组在5’和3’进行基因标记。进一步，利用密码子优化的Cas12a及OsU3、OsU6两个启动子分别驱动RCR1(HH核酶-CRISRP RNA1-HDV核酶)和RCR2(HH核酶-CRISRP RNA2-HDV核酶)的方法，一代获得15株ALS基因精准替换的纯合植株。以上研究为利用CRISPR/Cas12a系统实现农作物等位基因替换提供了一定的技术支撑。
3)CRISPR/Cas12a系统介导的以RNA为修复模板的水稻定点基因片段替换：利用体外RNA转录本，采用CRISPR/Cas12a核糖核蛋白复合体(Ribonucleoprotein，RNP)，基因枪转化水稻愈伤。然后，通过基因特异性PCR，证实了RNA转录本可以作为DNA修复模板，进行同源重组修复；进一步，利用微滴式数字PCR技术，采用RNP方法，在水稻愈伤中评估了DNA或/和RNA模板的修复效率。利用具有核酸酶活性的HH核酶和HDV核酶单元、CRISPR/Cas12a系统crRNA靶序列间隔DNA修复模板，采用U3启动子和Nos终止子，构建载体并通过基因枪转化水稻。通过细胞体内转录修复模板，转录本自我加工在细胞核内同时产生释放crRNA和RNA修复模板，实现了水稻ALS基因片段精准替换。经过后代分离，获得无转基因、抗除草剂水稻。建立了CRISPR/Cas介导、分别以DNA或/和RNA转录本作为修复模板的农作物等位基因替换体系，突破了基因片段替换所需模板递送困难的技术瓶颈。
综上所述，本研究实现了LbCas12a(RR)突变体在水稻基因组中的基因编辑，扩展CRISPR/Cas12a系统在水稻中的应用范围；利用含有两个同源臂和仅含左侧同源臂的DNA修复模板，实现了CRISPR/Cas12a介导的水稻ALS基因精准替换，初步解析了同源重组修复机制；在水稻中以RNA为修复模板，实现了CRISPR/Cas12a介导水稻定点基因片段替换，为通过农作物基因精准编辑，定向创制优异新种质新品种，提供了一定的依据和技术支撑。
1)构建了CRISPR/Cas12a介导的水稻基因编辑体系，并扩展CRISPR/Cas12a系统在水稻中的应用范围：利用LbCas12a的G532R/K595R突变体LbCas12a(RR)和G532R/K538V/Y542R突变体LbCas12a(RVR)，以水稻OsPDS和OsSBEIIb为靶标基因，检测突变体的编辑效果。结果表明，在水稻中，LbCas12a(RR)可通过识别5’-TYCV-3’PAM(其中Y=T\C；V=A\G\C)的PAM实现多基因和多位点编辑，拓展了LbCas12a在水稻中编辑范围，编辑效率最高达51%，对于推进CRISPR/Cas12a在植物基因编辑研究领域的应用具有重要意义。
2)CRISPR/Cas12a系统介导的以DNA为修复模板的水稻定点基因片段替换：以水稻ALS基因为靶基因，双链DNA为同源重组修复模板，通过载体和修复模板共转化，实现了水稻中ALS基因的片段替换，创制出抗除草剂水稻新种质。同时，当只有左侧同源臂时，仍然可实现同源重组。初步明确了当有修复模板存在时，CRISPR/Cas12a介导的DNA双链断裂修复主要遵循合成依赖修复机制。本研究结果简化了修复模板的设计，可促进利用基因编辑介导的同源重组在5’和3’进行基因标记。进一步，利用密码子优化的Cas12a及OsU3、OsU6两个启动子分别驱动RCR1(HH核酶-CRISRP RNA1-HDV核酶)和RCR2(HH核酶-CRISRP RNA2-HDV核酶)的方法，一代获得15株ALS基因精准替换的纯合植株。以上研究为利用CRISPR/Cas12a系统实现农作物等位基因替换提供了一定的技术支撑。
3)CRISPR/Cas12a系统介导的以RNA为修复模板的水稻定点基因片段替换：利用体外RNA转录本，采用CRISPR/Cas12a核糖核蛋白复合体(Ribonucleoprotein，RNP)，基因枪转化水稻愈伤。然后，通过基因特异性PCR，证实了RNA转录本可以作为DNA修复模板，进行同源重组修复；进一步，利用微滴式数字PCR技术，采用RNP方法，在水稻愈伤中评估了DNA或/和RNA模板的修复效率。利用具有核酸酶活性的HH核酶和HDV核酶单元、CRISPR/Cas12a系统crRNA靶序列间隔DNA修复模板，采用U3启动子和Nos终止子，构建载体并通过基因枪转化水稻。通过细胞体内转录修复模板，转录本自我加工在细胞核内同时产生释放crRNA和RNA修复模板，实现了水稻ALS基因片段精准替换。经过后代分离，获得无转基因、抗除草剂水稻。建立了CRISPR/Cas介导、分别以DNA或/和RNA转录本作为修复模板的农作物等位基因替换体系，突破了基因片段替换所需模板递送困难的技术瓶颈。
综上所述，本研究实现了LbCas12a(RR)突变体在水稻基因组中的基因编辑，扩展CRISPR/Cas12a系统在水稻中的应用范围；利用含有两个同源臂和仅含左侧同源臂的DNA修复模板，实现了CRISPR/Cas12a介导的水稻ALS基因精准替换，初步解析了同源重组修复机制；在水稻中以RNA为修复模板，实现了CRISPR/Cas12a介导水稻定点基因片段替换，为通过农作物基因精准编辑，定向创制优异新种质新品种，提供了一定的依据和技术支撑。