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目的:构建人转化生长因子-β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)的真核表达载体及对TGF-β1mRNA有抑制作用的TGF-β1短发夹RNA(shRNA)的表达质粒,再将两种重组质粒分别以脂质体介导的方法转染结肠癌细胞株,研究其对结肠癌细胞株分子生物学行为的不同影响,为阐明TGF-β1在结肠癌发生、发展和转移中的作用,以及为结肠癌的基因治疗提供实验研究依据。方法:(1)从人的肝脏组织中提取总RNA,通过RT-PCR方法获得人TGF-β1基因,将其克隆到真核荧光表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒pEGFP-N1-TGF-β1,转染真核表达细胞COS-7中,通过荧光显微镜检测其表达,RT-PCR和Western blot检测TGF-β1基因在真核细胞中的表达。(2)构建2对TGF-β1靶向RNA干扰重组表达载体(pshRNA-TGF-β1a, pshRNA-TGF-β1b)和1对阴性对照序列(pshRNA-TGF-β1c)。测序鉴定后,以脂质体介导转染结肠癌SW480细胞株,用RT-PCR和Western Blot检测转染前后TGF-β1基因的表达。(3)将构建的重组质粒pEGFP-N1-TGF-β1及2对干扰重组载体pshRNA-TGF-β1,分别转染结肠癌SW480细胞中,应用荧光显微镜观察其表达,RT-PCR和Western blot检测TGF-β1基因的表达情况。通过MTT检测细胞生长情况;流式细胞仪分析SW480细胞周期变化;Transwell侵袭试验验证TGF-β1对细胞侵袭能力的影响。结果:(1)通过RT-PCR方法克隆人TGF-β1基因为1173bp,与目的基因片段大小相一致;测序结果显示,于531位有1个碱基突变:T→C,为无义突变。通过RT-PCR和Western blot检测到TGF-β1基因的表达,其融合蛋白分子量约为52KD(绿色荧光蛋白分子量约为27KD),说明重组质粒在COS-7细胞内正常表达。(2)酶切鉴定和测序分析表明干扰重组质粒构建成功。经转染至SW480细胞后,TGF-β1mRNA水平和蛋白质的表达水平均显著降低。(3)转染重组质粒pEGFP-N1-TGF-β1后, RT-PCR和Western blot检测到TGF-β1基因的表达增强。SW480细胞的增殖受到明显抑制,细胞周期分析显示TGF-β1使细胞停留在G1期,S期细胞明显减少,SW480细胞的侵袭能力明显增强。转染干扰重组质粒的细胞,TGF-β1的表达水平明显下降,SW480细胞的侵袭能力下降,但细胞增殖及周期无明显变化。结论:转染pEGFP-N1-TGF-β1的肠癌SW480细胞,其增殖受到明显抑制,细胞周期在G1期,侵袭能力明显增强,SW480细胞的增殖和侵袭性的不一致作用可能是通过不同的信号路径实现的。而转染pshRNA-TGF-β1干扰载体SW480细胞侵袭能力下降,细胞的增殖和周期无明显变化。由此可见,TGF-β1在结肠癌的发生、发展及转移中确实起着至关重要的作用,利用RNAi技术,以TGF-β1基因为靶点的治疗,将有望成为改善结肠癌患者预后甚至治愈结肠癌的重要治疗策略之一。