非洲猪瘟（ASF）是一种由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的高传染性动物疾病,主要临床症状为猪的表面皮肤充血、发绀,内脏出血等。ASFV属于ASFV家族,有24种基因型,是一种具有四面体结构的线性双链DNA病毒,总长度为170-190 kb,包括151个阅读框和一个包膜,共编码将近200种蛋白质。P54蛋白作为ASFV的结构蛋白之一,位于病毒颗粒的内侧,分子量约为29 k Da。P54具有很强的保守性,是一种良好的免疫原,可作为ASFV抗体的检测抗原。非洲猪瘟的爆发给中国带来巨大经济损失,此外,在当前无疫苗的情况下,抗体检测阳性即可判定为ASFV感染,因此,本研究致力于ASFV抗体检测技术,选取p54作为检测抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法。由于间接ELISA方法使用的羊抗猪IgG-HRP能广泛针对其他猪病原抗体的检测,极易产生交叉反应或者假阳性的检测结果,继而,本研究利用ASFV p54蛋白制备了抗p54蛋白单抗,建立了阻断ELISA方法,致力于为非洲猪瘟临床检测提供最适的检测方法,同时为诊断和预防非洲猪瘟提供技术支持。主要研究内容如下:1.ASFV p54蛋白的表达及间接ELISA方法的建立将ASFV p54蛋白进行有效预测和截短,并将其与pET32a（+）连接,随后将重组质粒pET32a（+）-p54转化、诱导、超声破碎以及亲和层析纯化,得到ASFV p54-HIS蛋白。再将该蛋白经SDS-PAGE以及western blot验证其纯化效果以及免疫原性后,最后获得建立ELISA方法的包被抗原p54-HIS。为了获得检测准确的间接ELISA方法,本研究将该方法的各系数进行优化,如,p54-HIS的最佳稀释倍数、羊抗猪IgG-HRP的稀释倍数、最佳血清稀释倍数,各步骤的反应时间和温度。最终的结果是:在稀释倍数上:p54-HIS为1:5000（0.3μg/m L）,二抗为1:5000,待检血清为1:40;反应时间和温度分别为30 min和37℃。判定标准为:S/P≥0.25则为ASFV抗体阳性,S/P<0.25则为ASFV抗体阴性。随后,验证了该方法的重复性、特异性、以及符合率等方面的研究。结果显示,本研究建立的方法可重复性高;与商品化试剂盒相比,间接ELISA方法特异性方面与之相当;并且符合率高达100%,具有临床使用价值。2.抗p54蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立本研究表达的p54-HIS蛋白具有良好的免疫原性,将其免疫BALB/c小鼠,在此过程中同时表达用于筛选阳性克隆的筛选蛋白p54-GST,即将p54基因嵌入至pET42b（+）中,获得带有GST标签的pET42b（+）-p54重组质粒,利用原核表达系统将重组质粒进行表达,继而得到p54-GST蛋白。再经过细胞融合、双标签抗原筛选阳性克隆、三次亚克隆、腹水制备、腹水纯化等程序后,最后获得了3株抗p54蛋白单克隆抗体,随后通过ELISA检测所获得的3株单克隆抗体效价,最终挑选1株效价最高的单抗4-4C,将所获4-4C进行酶标记,获得的4-4C-HRP单抗作为后续研究对象。对4-4C单抗进行一系列特性验证:4-4C的亚类鉴定为IgG和lgκ;其效价为1.6×10~6;ELISA、western blot、IFA均表明4-4C能特异性识别ASFV。利用p54-HIS蛋白和单抗4-4C-HRP建立了检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。根据传统程序建立方法并进行条件优化,最终得到:p54-HIS的稀释倍数为1:4000（0.38μg/m L）,单抗4-4C的稀释倍数为1:22000（0.15μg/m L）,待检血清的最佳稀释倍数为1:1,血清和抗体的反应时间均为30 min,温度均在37℃。ASFV抗体阳性的判定标准是待检样品的阻断率≥50%,反之则判定为ASFV抗体阴性。随后,将阻断ELISA与西班牙英吉纳试剂盒进行灵敏度、特异性和符合率的平行比较,所得结果为:本研究的阻断ELISA方法灵敏度为1:64,而商品化试剂盒的灵敏度为1:32;在特异性和符合率方面,二者结果相当,为非洲猪瘟的检测提供技术支持。