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流行性乙型脑炎是由日本脑炎病毒(JEV)引起的一种蚊媒传播人兽共患病,在我国具有重要的公共卫生意义。多种动物均可被JEV感染,其中猪最易感,商品猪群多为隐性感染,感染妊娠母猪出现流产、木乃伊、死胎,感染公猪出现睾丸炎,给养猪业造成较大的经济损失。目前,尚无治疗流行性乙型脑炎的特效药物,预防主要依靠疫苗接种和防蚊灭蚊,因此,评价易感群体疫苗接种后抗体水平具有重要意义。本研究用JEVCap-ED3重组蛋白免疫BALB/c雌鼠,应用细胞融合技术制备了 4株能稳定分泌识别JEV ED3蛋白的单克隆抗体。间接ELISA、Western-blotting反应、间接免疫荧光试验、空斑减少中和试验和相加ELISA分析了这些单抗的效价、抗原性、中和活性、识别表位差异、交叉反应性等特性。在此基础上,本研究应用辣根过氧化物酶标记的JEV单克隆抗体5F9和JEV ED3重组蛋白和建立了检测动物血清中JEV抗体的阻断ELISA。通过与检测JEV抗体的间接ELISA对比试验评估了该方法的敏感性和特异性。应用该阻断ELISA对本实验室2014年收集的江苏省不同地区的牛羊鸡鸭血清样品进行了 JEV抗体的检测,并通过血清中和试验对检测结果进行了验证,结果表明,所建立的检测JEV抗体的阻断ELISA具有较好的特异性与敏感性。具体如下:1、日本脑炎病毒囊膜蛋白单克隆抗体的制备及特性分析本研究将JEV Cap-ED3重组蛋白免疫BALB/c雌鼠,应用细胞融合技术制备单克隆抗体,经ELISA筛选获得4株稳定分泌识别JEV ED3蛋白单抗的杂交瘤细胞,命名为1B10,3F5,4H1和5F9。这4株单抗在Western-blotting反应和间接免疫荧光试验中均能特异识别JEVNJ2008株。制备4株单抗的小鼠腹水,5F9效价最高,为1:409 600。空斑减少中和试验结果表明这4株单抗均没有中和活性。相加ELISA表明,这4株单抗中3F5和4H1识别相同抗原表位,1B10、5F9分别识别其它的抗原表位,且差异较大。因此,本研究获得了 4株JEV囊膜蛋白特异性的单抗,为JEV抗原和抗体检测试剂盒的研制提供了良好的素材。2、检测日本脑炎病毒抗体阻断ELISA的建立与评估本试验用纯化的JEV-ED3蛋白和辣根过氧化物酶标记的JEV单克隆抗体5F9建立了检测动物血清中JEV抗体的阻断ELISA。经筛选确定ED3重组蛋白的最佳包被浓度为0.05μg/ml,待检动物血清的最佳稀释度为1:1,酶标单抗最佳稀释度为1:2500。对58份猪JEV阴性血清阻断ELISA检测结果进行统计学分析,得出当阻断率%IN≥40,判定为阳性;当阻断率%IN<40,判定为阴性。用该方法与检测JEV抗体的间接ELISA对219份临床送检的猪血清样品进行对比检测,结果两种方法的符合率为98.17%。初步应用该方法对2014年实验室收集的江苏省不同地区的500多份牛羊鸡鸭血清样品进行检测,JEV抗体的阳性检出率依次为12.67%、4.67%、10.34%和44.44%。PRNT试验结果中猪、牛、羊阻断ELISA阳性血清均对JEV感染产生抑制;但鸡、鸭阻断ELISA阳性血清对JEV感染没有明显抑制,为了分析其原因,本研究测定了阻断ELISA阳性血清对鸭坦布苏病毒(DTMUV)的中和活性,发现只有鸭阻断ELISA阳性血清对DTMUV具有中和效果;对JEV与DTMUV的ED3蛋白氨基酸序列进行比较,发现同源性为62%～67%,理论上存在交叉抗原表位的可能。应用DTMUV特异性ED3抗原进行ELISA检测的结果表明,5F9识别的表位与DTMUV有交叉,1B10,3F5和4H1识别的抗原表位与DTMUV没有交叉。因此本试验建立的阻断ELISA适用于猪牛羊等大动物感染JEV抗体的检测,但检测禽类样品时会与DTMUV抗体有交叉反应。