软体动物贝壳是典型的生物矿化产物。马氏珠母贝Pinctada fucata martensii是研究生物矿化的良好材料。本研究以课题组组装获得的马氏珠母贝基因组精细图为参考,通过比较基因组、蛋白质组及转录组等多组学数据关联分析,研究参与贝壳形成的基质蛋白家族及其进化过程、发现与之相关的代谢通路和调控因子;利用RNA干扰、酵母双杂交以及双荧光素酶报告系统等多种研究方法对PmRunt上游信号分子、下游效应基因及其转录后调控因子的作用机制进行了研究。研究结果如下:1、组学分析发现矿化相关基因家族及调控因子（1）马氏珠母贝基因组进化分析本研究对马氏珠母贝、长牡蛎、帽贝、海蜗牛、章鱼、小头虫、水蛭、斑马鱼和人九个物种基因组序列进行基因家族聚类并对扩张和收缩的基因家族进行分析。以软体动物有壳类四个物种共同祖先与无壳的头足类章鱼的比较,发现贝壳形成的共同机制,即钙离子信号通路及矿质离子吸收、糖胺聚糖和多聚氨基糖生物合成及代谢为贝壳的形成提供了物种基础。对马氏珠母贝扩张收缩的基因家族进行分析,发现磺基转移酶扩张与贝壳珍珠层中高丰度的酸性粘多糖的性状相一致。对马氏珠母贝和长牡蛎共同扩张的贝壳蛋白家族进行分析,发现类纤连蛋白（FNL）可能在二者贝壳形成中均发挥重要作用;酪氨酸酶家族（TYR）的扩张可能导致马氏珠母贝贝壳酪氨酸酶蛋白独立分支的出现;含有VWA domain的蛋白家族（VWAP）可能对马氏珠母贝珍珠层形成的贡献力更大。对马氏珠母贝特有基因家族进行分析,发现具有氨基酸偏好性和重复单元的特有贝壳蛋白家族RLCD（related low complexity domain）在马氏珠母贝贝壳形成中发挥重要作用。（2）马氏珠母贝发育及组织转录组分析本研究以马氏珠母贝基因组精细图为参考,对马氏珠母贝发育及组织转录组样品进行转录组测序和分析。（1）担轮前期到担轮期、眼点期到变态后时期贝壳蛋白表达明显上调,分别与贝壳原壳和次生壳的形成一致,提示这两个阶段是贝壳形成的重要时期。（2）除外套膜组织是贝壳形成的主要器官,血细胞和闭壳肌对矿化基因也具有一定贡献。（3）对基因组进化分析获得的马氏珠母贝扩张的和特有的矿化相关基因家族表达模式进行分析,发现几丁质合成和代谢相关酶、磺基转移酶、TYRs、VWAPs、FNLs以及RLCDs,均有部分基因在担轮期或变态后时期表达量上调,同时在外套膜组织或珍珠囊中高表达,提示基因家族的倍增和基因功能分化、以及矿化相关种系特有基因的出现可能在贝壳的形态进化及形成中发挥重要作用。（4）分析了已知矿化相关调控因子的表达模式,同时对两个关键时期转录组差异表达基因进行功能富集,发现Wnt、BMPs、VEGF、MAPK、破骨细胞分化等信号通路以及Runt、SMAD、AP-1等转录因子可能在贝壳形成的调控中发挥重要作用;并且雌激素、维生素D3、甲状腺素和蜕皮激素可能参与变态后次生壳的形成。2、转录因子PmRunt及相关通路调控珍珠层的形成（1）PmRunt对珍珠层形成的调控通过组学的分析筛选获得可能参与贝壳形成的重要转录因子PmRunt,利用RACE技术对PmRunt进行了克隆,并对其配体PmCBF的CDS区进行了验证。PmRunt基因全长2319bp,5`端非编码区为82bp,3`端非编码区为599bp,编码的蛋白具有545个氨基酸。PmRunt含有典型的具有DNA结合能力的Runt结构域（RHD）,-COOH端存在VWRPY modif。PmRunt与脊椎动物的RUNX1相似度最高,系统进化分析发现脊椎动物和无脊椎动物的Runt protein分为独立的两支,软体动物的Runt protein来自同一祖先。酵母双杂交结果证明PmRunt和PmCBP蛋白之间存在相互作用。为了研究PmRunt对贝壳形成的影响,本研究以注射dsRFP组为阴性对照、利用dsRNA介导的RNA干扰使得PmRunt的表达发生显著性下调（P<0.05）,扫描电镜检测贝壳内表面,发现珍珠层的形成发生紊乱,暗示PmRunt参与贝壳珍珠层的形成。转录组测序发现多个珍珠层基质蛋白基因表达量在PmRunt干扰组发生显著性下调,其中包括carbonic anhydrase-like、TYR、VWAP、Mantle gene4（MG4）等。利用RO5-3335抑制剂抑制PmRunt与PmCBF的结合后,MG4（Pma₃18.183和Pma₁0000069）、VWAP（Pma₁0019836）、TYR2（Pma₁0029257）、Nacrein的表达量均发生显著性下调（P<0.05）,暗示这些基因可能受到PmRunt的直接调控。因此,本研究利用双荧光素酶报告系统检测了PmRunt与VWAP（Pma₁0019836）和Nacrein启动子区域的相互作用,发现PmRunt可以增强VWAP和Nacrein启动子的转录活性,提示PmRunt可能直接参与VWAP和Nacrein基因表达的调控。（2）PmRunt调控的MG4及其同源基因（C1qDC）参与贝壳珍珠层的形成MG4作为PmRunt下游的效应基因,属于C1q domain containing protein（C1qDC）家族。本研究对马氏珠母贝和长牡蛎发生扩张的C1qDCs的表达模式进行了分析,并对PmRunt调控的C1qDCs（Pma₃18.183、Pma₅76.501、Pma₁0000069、Pma₁0012374）在贝壳矿化中的功能进行研究。结果显示,尽管两个物种中C1qDC均出现明显的扩张现象,但马氏珠母贝中具有外套膜高丰度表达的集合,提示扩张的C1qDC参与贝壳矿化。利用RNA干扰技术显著性下调Pma₃18.183（MG4）、Pma₅76.501和Pma₁0012374在外套膜套膜区的表达（P<0.05）,SEM检测发现3个实验组的贝壳内表面珍珠层的形成发生了紊乱,因此C1qDCs可能影响贝壳珍珠层的形成。（3）蜕皮激素对PmRunt及贝壳矿化相关基因表达的调控在发育转录组比较分析中,发现蜕皮激素可能参与贝壳的形成。本研究对蜕皮激素受体及其结合蛋白RXR的CDS序列进行了验证。通过Elisa方法检测贝壳损伤后血清中蜕皮激素含量的变化,发现蜕皮激素在缺壳后2h显著性上调（P<0.05）,4h时的浓度最高,而36h的上调与贝壳损伤修复膜的出现一致,暗示蜕皮激素可能与贝壳的修复相关。利用40ng/L的蜕皮激素浸泡处理外套膜套膜区小片,转录因子PmRunt、AP-1、BMP2/7、VWAP、TYR2、KRMP和CHS的表达均发生显著性变化（P<0.05）,以上结果提示蜕皮激素可能调控PmRunt的表达,同时也参与其他矿化相关基因的调控影响贝壳的形成。3、microRNA调控PmRunt及NF-κB通路基因表达本研究利用体外细胞实验和Pm-miR-183活体过表达实验检测Pm-miR-183对PmRunt的调控作用,结果显示Pm-miR-183与包含PmRunt的3`UTR区域的pmiRreport载体共转染293T细胞后,荧光素酶活性发生显著性下调（P<0.05）;注射PmmiR-183 mimics类似物后,马氏珠母贝外套膜组织中的Pm-miR-183表达量发生显著性上调（P<0.05）,PmRunt的表达量发生显著性下调（P<0.05）,同时珍珠层的形成发生紊乱,以上结果表明Pm-miR-183可能通过与PmRunt的3`-UTR互作抑制基因的表达,参与珍珠层形成的调控。本研究利用生物信息学分析获得马氏珠母贝Pm-miR-146a,并利用茎环引物特异性反转录,qRT-PCR检测Pm-miR-146a在不同组织的表达量,结果显示Pm-miR-146a在各个组织中均有表达,在外套膜组织的表达量较高,在血液中的表达量较低。miRanda软件预测发现Pm-miR-146a与巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）存在靶向作用,注射Pm-miR-146a mimics类似物后,血细胞中Pm-miR-146a的表达量发生显著性上调,同时MIF和NF-κB的表达量发生显著性下调（P<0.05）。以上结果暗示Pm-mi R-146a可能通过调控MIF的表达参与NF-κB通路的负调控。