牙周炎是发生在牙周结缔组织及牙槽骨中的慢性感染性疾病,其病理过程主要受到局部因素(细菌感染)和系统因素(宿主免疫)的双重调控。体内激素变化也被认为能够影响牙周炎病理过程。以往对绝经后骨质疏松的研究着重在E2水平的降低,而忽视了FSH水平的增高。直至Mone Zaidi等科学家提出FSH能促进破骨细胞活性而直接参与骨改建,FSH在绝经后骨质疏松中的作用才引起学者们的关注。研究发现,破骨细胞及其前体细胞均表达FSHR,绝经后高水平FSH能够促进破骨细胞及其前体细胞成熟,独立于E2在绝经后的骨质代谢中发挥作用。同时,实验表明,FSH能够促进牙槽骨吸收,FSH的抑制剂能够有效地抑制这一促进作用,证明FSH能独立于E2而作用于牙槽骨。环氧化酶(COX,也称为前列腺素内氧化酶还原酶),是催化花生四烯酸转化为前列腺素的关键酶。目前主要发现有两种同工酶-COX-1和COX-2。COX-1在大多数细胞中组成性表达并调节正常的生理反应,而COX-2在正常情况下检测不到其表达,当机体受到包括IL-1、TNF-α和LPS等炎症因子刺激时,体内COX-2的表达将会增高。因此,当机体受到炎症因子刺激时,COX-2是控制合成PGE2的主要功能酶。COX-2和COX-2介导合成的PGE2在牙周炎中发挥关键作用,包括刺激炎症因子产生和增加破骨细胞的分化。既然FSH和COX-2都能促进破骨细胞分化,那么在牙周炎中两者之间是否有联系呢?同时,CCL2、CCL3、CCL5作为牙周组织中重要的趋化因子,FSH是否能通过促进其表达而加速牙周炎炎症?围绕着这两个问题,本课题研究内容包括以下两个部分。一)：建立OVX及实验性牙周炎大鼠模型,通过建立假手术组及注射FSH抑制剂等操作,验证FSH能促进牙槽骨吸收,探寻FSH对COX-2表达的影响,同时研究FSH促进COX-2及PGE2的表达的相关机制。二)：通过用FSH刺激PDLCs,观察FSH对CCL2、CCL3、CCL5表达的影响,以判断FSH是否促进PDLCs的免疫趋化作用。第一部分FSH通过调控COX-2表达促进牙槽骨的吸收第一章OVX及实验性牙周炎大鼠模型的建立实验一SD雌性大鼠双侧OVX以及牙周炎模型的建立实验目的：构建SD雌性大鼠双侧OVX以及实验性牙周炎模型材料和方法：选择8周大的SD雌性大鼠,重量在200-220g之间。所有大鼠随机分组,根据不同的操作分为以下四组：双侧卵巢切除组(OVX),OVX+GnRH-a注射组,SHAM+GnRH-a注射组,SHAM组。注射4%水合氯醛麻醉(0.35 mL/100g),待完全麻醉后所有老鼠进行下颌第一磨牙牙周丝线结扎术；在双腹部切口寻找卵巢组织,彻底结扎并且切除,假手术中切除卵巢周围与卵巢同等大小脂肪组织作为对照,随后分别缝合肌肉层和皮肤。手术结束后,OVX+GnRH-a组和SHAM+GnRH-a组大鼠在大腿处立即肌肉注射GnRH-a(1.6mg/kg)术后每周检查牙周韧带结扎丝线脱落及双侧背部伤口愈合情况。4周后,注射过量的麻药处死所有大鼠,取大鼠下颌骨标本,标本固定后,对右侧下颌骨标本进行Mirco-CT三维扫描,左侧标本经过脱钙脱水浸蜡包埋后,制作4微米切片备用。结果：使用上述方法可以成功建立双侧OVX以及实验性牙周炎大鼠模型。取材后,两侧下颌骨分别进行Micro-CT扫描分析及免疫组化实验。实验二FSH对大鼠下颌牙槽骨破坏的影响实验目的：验证FSH能促进大鼠下颌牙槽骨的吸收材料和方法：手术四周后,处死所有大鼠,取下颌骨,用4%多聚甲醛固定36小时。自来水冲洗2小时,自制扫描纸板,将标本垂直放在纸板上,在如下条件下进行扫描：层面厚度：20μm；图像矩阵：1024×1024;电压：70 kV；电流：114μA。扫描结束后重建大鼠下颌骨模型,用Mimics软件测量釉牙骨质界到牙槽脊顶的距离(CEJ-ABC),并分析下颌骨第一磨牙根分叉区域的骨体积分数(Bone volume fraction, BV/TV)。对上述两种指标进行定量分析以评价各组牙槽骨吸收程度。结果：四组CEJ-ABC的距离为：OVX组：0.9±0.01mm;OVX+GnRH-a组：0.71±0.07mm;SHAM+GnRH-a组：0.769±0.08 mm；SHAM组：0.76±0.08 mm。OVX组比OVX+GnRH-a组或SHAM组有更大的CEJ-ABC值(P<0.05),结果具统计学差异。其余三组差异不具有统计学意义。OVX组与OVX+GnRH-a组及SHAM组相比有更小的BVATV值(P<0.05),结果具有统计学差异。其余三组差异不具有统计学意义。结果表明,OVX组与其他三组相比,有更严重的牙槽骨吸收,并且GnRH-a能有效的抑制FSH对牙槽骨的吸收作用。实验三FSH对大鼠牙槽骨COX-2表达的影响实验目的：探讨FSH是否促进大鼠牙槽骨中COX-2的表达材料和方法：本实验使用免疫荧光双标及免疫组化检测下颌骨组织切片中FSHR及COX-2的表达。免疫荧光双标是采用不同的荧光信号(FSHR:绿色荧光信号,COX-2:红色荧光信号)标记同一张组织切片上FSHR和COX-2的表达,最后合成图片,观察FHSR及COX-2共表达的区域。COX-2免疫组化检测下颌骨PDLCs中COX-2的表达情况,并做定量分析.结果：在荧光显微镜下,使用相同的光源强度及曝光时间,在同一区域分别拍摄细胞核(蓝色)、FSHR(绿色荧光)、COX-2(红色荧光)照片,最后将三张照片进行重叠。FSHR与COX-2荧光信号重叠后显示为黄色。可以从结果中观察到OVX组黄色高于其他组。COX-2的免疫组化结果显示,在第一磨牙牙周膜处可观察到黄色或褐色的COX-2阳性表达细胞,表达主要集中在根分叉区域。COX-2阳性细胞定量分析结果显示,OVX组COX-2表达明显高于其他三组(P<0.05),并具有统计学差异,两SHAM组中COX-2表达不具有统计学差异。第二章培养人PDLCs研究体外FSH对COX-2及PGE2表达的影响实验一PDLCs的培养及鉴定实验目的：人PDLCs的培养和鉴定材料和方法：本实验收集因正畸拔除的年轻前磨牙,在无菌条件下用PBS冲洗牙齿,取根三分之二处的牙周膜,切成大小为1mm2的组织块,贴在T25培养瓶上,加入含有1%的P/S和10%的FBS的DMEM中培养。待PDLC长至第四代或者第五代,以合适的浓度将细胞种在细胞爬片上,细胞数目增值到80%左右时,用4%多聚甲醛固定爬片,并通过细胞免疫荧光检测间充质来源以及形态相关的蛋白表达,证明此细胞是否为牙周膜细胞。结果：组织块法培养七到三十天后,可在显微镜下观察到有幼小的牙周膜细胞从组织块爬出,PDLCs呈较短的长梭型,透明度大且胞质丰满,胞核圆形或椭圆型,位于细胞中央,以组织块为中心放射性增长。荧光显微镜下观察波形蛋白(vimentin)、纤维连接蛋白(fibronectin)和1型胶原蛋白(COLI)表达为阳性,角蛋白(keratin)则为阴性表达,证明此细胞的间充质来源。实验二体外FSH对PDLCs中COX-2表达的影响实验目的：探讨体外FSH是否促进COX-2的表达材料和方法：首先确认PDLCS表达FSHR。收集PDLCs总蛋白,用western-blot检测PDLCs是否表达FSHR,小鼠卵巢组织蛋白作为阳性对照。将第四代或第五代PDLCs种在细胞爬片上,待细胞数目增值到70%左右时,用4%多聚甲醛固定爬片,并通过细胞免疫化学法检测PDLCs中FSHR的表达,并设立阴性对照。将第四或者第五代PDLCs以1*106个/孔的密度种在六孔板上,贴壁12小时后,用不含有酚红的DMEM培养基过夜,用浓度为30ng/mL的FSH刺激PDLCs,刺激时间为0、2、4、6、8、12、24小时。收集mRNA和总蛋白,分别用qRT-PCR和western-blot测量COX-2表达水平。结果：Western-blot结果显示PDLCs及小鼠卵巢组织同时表达FSHR。细胞免疫化学结果显示PDLCs中FSHR蛋白呈阳性表达,同时阴性蛋白无表达。FSH同时促进PDLCs中COX-2mRNA(P<0.05)及蛋白水平的表达,且表达增长呈时间依赖性。此结果与第一章中FSH促进大鼠PDLCs中COX-2表达的结论一致。实验三体外FSH对PGE2表达的影响实验目的：探讨体外FSH是否促进PGE2的表达材料和方法：将第四或者第五代PDLCs以1*106个/孔的密度种在六孔板上,贴壁12h后,用不含有酚红的DMEM培养基过夜,用浓度为30ng/mL的FSH刺激PDLCs 0、6、24小时,随后收集总蛋白,用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测牙周膜细胞的PGE2含量。结果：ELISA结果显示PGE2表达随时间递增而增加(P<0.05),其差异具有统计学意义。此结果提示FSH通过调控COX-2增加了PGE2的表达。第三章：探讨FSH促进COX-2和PGE2表达可能涉及的通路实验一检测FSH对PDLCs中Erk、Akt、p38信号通路表达的影响实验目的：验证FSH促进了PDLCs中Erk、Akt、p38信号分子的表达材料和方法：将第四或者第五代PDLCs以1*106的密度种在六孔板上,贴壁12小时后,用不含有酚红的DMEM培养基过夜,用FSH刺激牙周膜细胞0、10、15、30、60分钟,收集蛋白后用western-blot测量p-Erk、Erk、p-Akt、Akt、p-p38、p38信号分子表达水平。实验结果：结果表明,FSH能促进p-Erk、p-Akt、p-p38蛋白的表达,同时,Akt和p38的表达水平保持不变。虽然FSH促进了Erk总蛋白的表达,但灰度分析显示,p-Erk相对于Erk,其表达呈增高的趋势。实验二探讨阻断Erk、Akt、p38通路后体外FSH对COX-2表达的影响实验目的：检测Erk、Akt、p38通路被抑制时体外FSH对COX-2表达的影响材料和方法：将第四或者第五代PDLCs以1*106的密度种在六孔板上,贴壁12小时后,用不含有酚红的DMEM培养基过夜,分别加入Erk、Akt、p38通路的特异性抑制剂作用2小时,再加入30 ng/mL的FSH刺激6小时,20 ug/mL的LPS作为阳性对照,并设立阴性对照。收集mRNA和总蛋白,通过qRT-PCR和western-blot分析COX-2的表达水平。结果：qRT-PCR和western-blot均显示在阻断Erk、Akt、p38通路后,COX-2的mRNA和蛋白表达与FSH组相比均下降(P<0.01)。其中,阻断通路组的COX-2的]mRNA和蛋白表达水平均低于阴性对照组(P<0.01)。qRT-PCR结果显示FSH组(P<0.01)与LPS组中COX-2的mRNA(P<0.05)表达水平显著性高于阴性对照组,且差异具有统计学意义。Western-bolt结果中LPS组COX-2蛋白表达明显高于FSH组及阴性对照组,FSH组高于阴性对照组。实验三检测阻断Erk、Akt、p38通路时体外FSH对PGE2表达的影响实验目的：探讨Erk、Akt、p38通路被抑制时体外FSH对PGE2表达的影响材料和方法：用FSH刺激PDLCs之前分别加入Erk、Akt、p38通路的特异性抑制剂反应2小时,之后再用FSH刺激6小时,同时设立阳性和阴性对照。收集总蛋白,通过ELISA试剂盒检测各组PGE2的含量。结果：ELISA结果显示阻断Erk、Akt、p38通路后PGE2的表达水平显著低于FSH组(P<0.01),其中FSH组高(P<0.05)于阳性和阴性对照(P<0.01),LPS组高于阴性对照(P<0.05),差异均具有统计学意义。第二部分检测FSH对PDLCs中趋化因子表达的影响实验一FSH对CCL2、CCL3、CCL5表达的影响实验目的：检测FSH对PDLCs CCL表达的影响实验方法：将第四或者第五代PDLCs以1*106的密度种在六孔板上,贴壁12小时后,用不含有酚红的DMEM培养基过夜,之后用浓度为100、30、10、lng/mL的FSH刺激PDLCs6小时,20 ug/mL的LPS作为阳性对照,同时设立阴性对照。收集RNA和细胞上清,分别用qRT-PCR和ELISA检测CCL2、CCL3和CCL5的mRNA和蛋白表达水平。结果：qRT-PCR结果显示CCL2的mRNA表达在各组之间没有任何统计学差异。CCL3FSH100ng/mL组的mRNA表达水平低于阴性对照组(P<0.05),FSH30ng/mL组的mRNA表达水平高于阴性对照组(P<0.05),且均具有统计学差异；其他组与阴性对照组相比,不具有统计学差异。CCL5FSH100ng/mL组的mRNA表达水平高于阴性对照组(P<0.05),FSH30ng/mL组的mRNA表达水平低于阴性对照组,且均具有统计学差异(P<0.05)；其他组与阴性对照组相比,不具有统计学差异。CCL2 FSH 1ng/mL组蛋白表达水平低于于阴性对照组,LPS组CCL2的蛋白表达高于阴性对照组,具有统计学差异,其他组与阴性对照组相比,不具有统计学差异。多次ELISA实验未检测出CCL3、CCL5的蛋白含量。结论：1.成功建立OVX与实验性牙周炎大鼠模型,验证了绝经后FSH能促进大鼠牙槽骨吸收,与之前的研究结论一致。2.第一次提出了FSH促进牙槽骨吸收可能涉及的机制,即FSH通过调控COX-2及PGE2的表达促进牙槽骨的吸收。3.本实验研究表明,FSH促进牙槽骨吸收的过程可能涉及了Erk、Akt、p38信号通路。4.目前结果显示FSH不促进CCL2对PDLCs的趋化作用,尚不能证明FSH促进CCL3和CCL5对PDLCs的免疫趋化作用。