论文部分内容阅读
睾丸支持细胞(SCs)具有分泌多种细胞因子与营养物质的功能,能滋养或促进共培养细胞的增殖或分化,且可形成局部免疫豁免的功能。骨髓间充质干细胞(bmMSCs)作为源自于骨髓的间充质干细胞,bmMSCs在不同的诱导条件下可以分化为多种跨胚层细胞,在组织工程领域具有广泛的研究价值。本论文主要对SCs与bmMSCs分离鉴定、SCs促进bmMSCs定向分化及分化的特性进行初步研究,并建立了利用搅拌式生物反应器实现bmMSCs在微载体上大量增殖的方法,并对扩增后的bmMSCs进行生理特性的研究。具体结果如下：(1)SCs被从10d大的小鼠睾丸中成功分离与鉴定。经苏木精伊红染色与电子扫描显微镜鉴定为支持细胞,具有明显的双核仁特征；通过对培养基与转瓶微载体培养体系的工艺优化,成功实现SCs大量扩增,支持细胞由初始2.25×105cells/ml的接种密度增殖至2.37×106cells/ml。(2)利用密度梯度离心的方法从骨髓中成功分离出bmMSCs。体外培养时呈现典型的鱼群或漩涡状排列,经流式细胞术检测表面抗原CD29. CD90与CD34鉴定为bmMSCs。通过检测不同血清浓度对bmMSCs体外增殖的影响,发现高浓度血清培养可能会引起bmMSCs分化,影响bmMSCs的生理特性,因此确定含1%FBS的培养基更适宜bmMSCs的体外培养。(3)采用两种细胞共培养与条件培养基(CM)的培养模式,进行SCs促进bmMSCs定向分化为软骨细胞与成骨细胞的特性研究。通过免疫细胞化学、细胞化学、RT-PCR与、Vestern-blot等方法进行检测,结果表明SCs能够显著促进bmMSCs定向分化。(4)建立1.5L搅拌式生物反应器的bmMSCs体外大规模扩增的微载体培养方法。在细胞与微载体接种密度分别为2.5×105cells/ml与4mg/ml,搅拌速率实时调控的条件下,利用Cytodex3微载体与低血清(1%)培养基以及1.5L搅拌式反应器,成功地实现了bmMSCs体外大规模扩增。通过每24h更换50%培养基的策略,bmMSCs的扩增倍数达到了10.4倍,最大细胞密度达到2.6x106cells/ml。通过流式细胞术与定向分化检测,用胰酶从微载体上消化下的bmMSCs仍能保留其表型特征以及分化为软骨与成骨细胞的潜能。