论文部分内容阅读
目的：不孕症患者逐年增多，女性不孕患者中约有1/2为输卵管疾患所致，而输卵管积水所致不孕又占输卵管疾患的10％-30％。IVF-ET技术可以解决输卵管不通患者的受孕问题。在IVF-ET治疗中发现，与其它原因所致不孕的妇女相比，输卵管积水妇女胚胎种植率及妊娠率均下降50％，自然流产率增加2倍。而有研究发现腹腔镜下输卵管切除术或根部离断后再行IVF-ET治疗，可明显提高妊娠率和活产率。目前关于输卵管积水导致低妊娠率的可能机制有3种：机械冲刷理论、胚胎或配子毒性理论以及影响子宫内膜容受性理论。近年来子宫内膜容受性已成为生殖领域学者们研究的热点。杜国平等应用抑制性消减杂交技术[4](suppressionsubtractive hybridization，SSH)筛选出了子宫内膜容受性有关基因，如glycodelin基因、galectin-3基因等。本研究通过分析glycodelin及galectin-3mRNA及蛋白在输卵管积水组(观察1组)、输卵管积水术后组(观察2组)及无输卵管积水组(对照组)窗口期子宫内膜的表达，评价glycodelin及galectin-3与子宫内膜容受性的关系，进一步探讨输卵管积水影响子宫内膜容受性的机制，为可疑输卵管积水患者是否需要在IVF-ET前行输卵管切除术提供依据。 方法：从子宫内膜容受性相关的差异表达基因文库中筛选出的与子宫内膜容受性相关的基因中选择glycodelin及galectin-3进行研究。选择2010年1月～2010年10月在河北医科大学第四医院生殖医学科就诊的女性不孕患者40例，年龄22-36岁，平均不孕年限3.2 a。月经周期规则(25-32d)，基础内分泌检查正常，无其他内分泌、免疫及代谢性疾病。不孕原因为输卵管因素、宫颈病变、男性精子异常。25例经欧乃派克输卵管造影或经腹腔镜检查证实为输卵管积水(观察1组)，其中23例接受腹腔镜输卵管根部离断术(观察2组)；另15例经欧乃派克输卵管造影证实无输卵管积水(对照组)。在预计排卵前3-4 d，连续阴道超声监测患者卵泡发育至18-20 mm并排出，卵泡排出日为排卵第1日，排卵第6-8日为着床窗口期。取观察1组经腹腔镜离断输卵管前及观察2组术后1个月窗口期子宫内膜及对照组窗口期子宫内膜。所取内膜部分液氮冻存用于mRNA测定，部分4％甲醛固定用于免疫组化检测蛋白表达。应用RT-PCR检测技术，分别取观察1组、观察2组及对照组子宫内膜各约50 mg加入Rezol1 ml置匀浆器内充分匀浆，提取总RNA，取出0.5μl，进行反转录得cDNA，继而进行PCR扩增。glycodelin的上游引物序列为：5-AGT TCA AGA TCAACT ATA CGG-3下游引物序列为：5-GTC CAG CAA GTA CCA TAG G-3，扩增片段长度为215 bp。galectin-3上游引物序列为：5-GAA TGA TGTCTT CCA C-3，下游引物序列为：5-CAC TGG TGA GGT CTA TGTCAC-3，扩增片段长度为278bp。同时以β-actin作为内参照，β-actin的上游引物序列为：5-CGG CAA ATC GTG CGT GAC-3，下游引物序列为：5-TGG AAG GTG GAC AGC GAG G-3，扩增片段长度为434 bp。25μl的PCR反应体系包括上、下游引物(10 pmol/μl)各1μl，cDNA2μl，PCR循环条件为：94℃5 min，1个循环；94℃40 s，60℃40 s，72℃50 s，30个循环；72℃10 min，1个循环。产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，用VDS图像分析系统进行照相和图像分析。IOD值经内参照校正，将校正值进行统计学分析。应用免疫组化检测：将子宫内膜用4％甲醛固定后石蜡包埋，制备4μm厚连续组织切片。分别进行HE和ABC免疫组化染色。脱蜡、消化、高压抗原修复、封闭、加入一抗(单克隆兔抗人glycodelin稀释浓度为1:100；单克隆小鼠抗人galectin-3稀释浓度为1:100)、二抗、DAB显色、苏木素复染、脱水后透明、中性树胶封片。用PBS代替一抗做阴性对照。显微镜观察并拍照。阳性判断标准：每张染色片随机选取5个视野，以背景清晰、细胞质着色呈棕黄色为阳性，分为4个等级：细胞均无任何阳性染色为“-”；25％以下细胞阳性染色为“+”；25％-50％细胞阳性染色为“++”；50％以上细胞阳性染色“+++”。所有数据采用SPSS11.5统计软件进行统计分析。计量资料采用x±s表示，组间差异采用t检验，以α=0.05为检验标准，当P<0.05时差异有显著性。 结果：各组窗口期子宫内膜glycodelin mRNA表达观察1组、观察2组及对照组窗口期子宫内膜glycodelin mRNA表达水平分别为0.19±0.03、0.52±0.07、0.75±0.03，两两比较，P均<0.05。各组窗口期子宫内膜glycodelin蛋白表达glycodelin蛋白在对照组窗口期子宫内膜的腺上皮细胞表达，且表达呈强阳性+++。glycodelin蛋白在观察1组窗口期子宫内膜表达极低，几乎呈阴性-。但在输卵管离断后表达明显上调，呈中等强度阳性++。各组窗口期子宫内膜galectin-3 mRNA表达观察1组、观察2组及对照组窗口期子宫内膜galeetin-3 mRNA表达水平分别为0.07±0.02、0.41±0.07、0.54±0.13，两两比较，P均<0.05。各组窗口期子宫内膜galectin-3蛋白表达galectin-3蛋白在对照组窗口期子宫内膜的腔上皮、腺上皮和间质细胞均有表达，且表达呈强阳性+++。galectin-3蛋白在观察1组窗口期子宫内膜表达明显低于对照组，呈弱阳性+。但在输卵管离断后表达明显上调，呈中等强度阳性++。 结论：glycodelin及galectin-3是子宫内膜容受性相关基因之一，本研究显示输卵管积水患者着床窗口期子宫内膜容受性欠佳，glyeodelin及galectin-3的低表达可能是造成输卵管积水患者子宫内膜容受性低的原因之一。