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第一部分长期α-亚麻酸干预对自然衰老大鼠学习记忆能力的影响目的：衰老是机体不可避免的一种正常而复杂的过程,认知功能减退是其重要标志之一。α-亚麻酸(α-linolenic acid,ALA)作为人体必需的一种不饱和脂肪酸,具有良好的神经保护和抗衰老作用。本部分旨在探讨长期ALA摄入对自然衰老模型大鼠学习记忆功能的影响。方法：将160只Specific-pathogen free(SPF)级6月龄雌性Sprague-Dewley大鼠(体重250-300g)随机分为4组,即老年对照组(Aged),高脂对照组(high fat,HF),低剂量亚麻油干预组(L-ALA)和高剂量亚麻油干预组 (H-ALA).Aged组给予AIN-93M饲料,HF组给予10%(w/w)猪油高脂饲料；L-ALA组给予5%(w/w)猪油高脂饲料和5%(w/w)亚麻油；H-ALA组给予10%(w/w)亚麻油,持续喂养12个月。另外选择30只相同来源和相同遗传背景的3月龄雌性SD大鼠作为年轻对照组(Young),给予AIN-93M饲料喂养1个月。监测各组大鼠每天的摄食量和每周体重,计算食物功效比(food effciency ratio,FER);采用Morris水迷宫测试评估老年大鼠(18月龄)和年轻大鼠(4月龄)的空间学习记忆能力；大鼠处死后,称量主要脏器重量、HE和尼氏染色检查脑组织病理学改变、气相色谱法分析海马和皮质脂质成分的改变。结果：对4组老年大鼠为期12个月的动态监测显示,HF大鼠体重增量和摄食量均最多,并具有最高的FER(均为P<0.05)；添加ALA后,大鼠体重增加减缓,摄食量减少,FER也降低。与Young组大鼠相比,Aged和HF组大鼠在定位巡航实验中到达平台的潜伏期和路径显著延长(均为P<0.05),在空间探索试验中穿越目标象限的时间和路径均明显减少(均为P<0.05)；ALA干预能剂量依赖性地缩短大鼠的潜伏时间,并增加其在目标象限的定位(均为P<0.05)。病理检查显示Aged和HF大鼠脑组织内出现明显的组织学异常改变和神经元数目减少,而ALA处理能显著减轻衰老和/或高脂引起的上述改变。脂质成分分析显示,与非ALA处理组(Young、 Aged和HF)相比,两ALA干预组大鼠皮质和海马区ALA及其代谢产物DHA和EPA含量均较明显增加(均为P<0.05),n-3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)水平上升而n-6 PUFAs减少,引起(n-6)/(n-3)比值下降,不饱和系数明显升高(P<0.05)。结论：长期膳食ALA干预可调节自然衰老大鼠脑内脂肪酸含量,保护神经元,并改善老年学习记忆功能。第二部分长期补充ALA活化海马CREB信号转导通路增强自然衰老大鼠学习记忆功能的机制研究目的：突触可塑性降低是年龄相关性学习记忆改变的主要机制,环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(cyclic AMP-response element binding protein, CREB)在神经元存活、记忆固化、突触修饰等方面具有关键性的作用。本部分研究旨在探讨膳食ALA改善年龄相关性的认知障碍与CREB信号通路的关系及其潜在的分子机制。方法：将经过Morris水迷宫测试的大鼠断头处死,迅速分离脑皮质和海马组织。应用透射电子显微镜下观察大鼠海马CA1区超微结构的改变；Western blot方法和real-time PCR方法检测ALA对皮质和海马CREB信号转导通路及其上游调节因子细胞外信号相关激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/Akt)、蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)和钙调蛋白激酶Ⅳ (calcium calmodulin kinase IV, CaMKIV)的表达。结果：神经元超微结构观察结果显示,Aged和HF组大鼠与Young组相比,神经元内突触数明显减少(均为P<0.05),脂褐素沉积明显,伴有突触后致密物降低和突触间隙的宽度增加(均为P<0.05)：添加ALA能显著改善衰老和／或高脂引起的突触结构的异常改变。脑功能蛋白检测结果发现,Aged和HF组大鼠较Young组海马CREB-P表达水平降低,下游脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA和蛋白表达下降,其高亲和力受体酪氨酸激酶B(tyrosine kinase B, TrkB)的磷酸化水平也降低(均为P<0.05);给予ALA膳食能够显著增强CREB-BDNF-TrkB信号通路的表达(均为P<0.05)。皮质相关蛋白和基因表达未受影响(P>0.05)。对活化CREB的上游调节因子分析显示,海马ERK和Akt在各组的磷酸化状态与CREB-P一致;而CaMKIV-P和PKA的表达未受影响。结论：衰老和高脂会降低海马CREB信号通路的表达,损害衰老大鼠的学习记忆功能；长期膳食ALA干预可呈海马依赖性地活化ERK和Akt介导的信号通路,调节CREB活性,增强突触可塑性,从而改善自然衰老模型大鼠的学习记忆能力。第三部分长期补充ALA调节PERK/eIF2a信号转导通路对自然衰老大鼠阿尔茨海默病样改变的保护作用目的：细胞外p-淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ聚集沉淀形成的老年斑和细胞内过度磷酸化的Tau蛋白形成的神经原纤维缠结作为阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的典型病理特征,也发生于生理性老化的进程中。近来研究发现内质网应激在AD病变早期发生特定的保护作用。本研究旨在验证衰老进程中是否出现AD样病理改变,并在此基础上进一步探讨内质网应激在ALA改善AD样病理中的作用机制。方法：将160只SPF级6月龄雌性Sprague-Dewley大鼠(体重250-300g)随机分为4组,即老年对照组(Aged),高脂对照组(HF),低剂量亚麻油干预组(L-ALA)和高剂量亚麻油干预组(H-ALA)。Aged组给予AIN-93M饲料,HF组给予10%(w/w)猪油高脂饲料；L-ALA组给予5%(w/w)猪油高脂饲料和5%(w/w)亚麻油；H-ALA组给予10%(w/w)亚麻油,持续喂养12个月。另外选择30只相同来源和相同遗传背景的3月龄雌性SD大鼠作为年轻对照组(Young),给予AIN-93M饲料喂养1个月。处死大鼠后,制作脑组织切片进行刚果红和硫黄素T染色,观察Aβ在脑实质和血管的沉积：酶联免疫吸附试验检测皮质和海马区Aβ40和Aβ42水平;免疫组织化学法染色检测脑内磷酸化Tau蛋白(pS396-Tau)水平,观察是否出现了AD样病理改变；Western blot方法p-分泌酶(β-site APP-cleaving enzyme 1, BACE1)对p-淀粉样前体蛋白(amyloid-β precursor protein, APP)的剪切,以及tau蛋白的上游调节分子糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)的活化；同时,检测ER应激和未折叠蛋白反应的蛋白激酶RNA样内质网激酶／真核起始因子2α(protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase/eukaryotic Initiation Factor 2α,PERK/eIF2α)信号分支(调控BACE1和GSK-3β活化的关键信号转导通路)分子mRNA和蛋白的表达水平。结果：与Young组大鼠相比,Aged和HF组大鼠脑实质和血管内淀粉样斑块阳性染色明显增多(均为P<0.05),并伴有淀粉样血管变性;Tau-P的阳性表达显著升高(均为P<0.05),表明自然衰老大鼠出现AD样病理改变：ALA干预后能显著减少脑实质和血管中Aβ聚集引起的淀粉样蛋白沉积,减轻Tau病理。进一步研究发现,长期补充ALA通过调节PERK/eIF2α信号通路,一方面,降低BACE1蛋白活性以减少APP生成Ap；另一方面,抑制GSK-3β的活化而减少Tau蛋白的磷酸化。结论：自然衰老进程中脑内出现了AD样病理改变；长期补充ALA能够通过抑制ER应激和未折叠蛋白反应的PERK/eIF2α信号转导通路,改善衰老相关的AD样病理学症状。