【摘 要】
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目的:本研究旨在探讨DRP-1介导的线粒体自噬在T-2毒素诱导小鼠睾丸间质细胞（TM3）细胞凋亡中的作用及其机制。方法:本试验以TM3细胞为研究对象,用不同浓度的T-2毒素（0、1、10和100n M）处理TM3细胞24h后进行以下试验:（1）T-2毒素对TM3细胞线粒体自噬的影响:Western blot检测自噬相关蛋白LC3-II和P62的表达;透射电镜观察细胞中自噬小体的变化;将RFP-GF
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目的:本研究旨在探讨DRP-1介导的线粒体自噬在T-2毒素诱导小鼠睾丸间质细胞（TM3）细胞凋亡中的作用及其机制。方法:本试验以TM3细胞为研究对象,用不同浓度的T-2毒素（0、1、10和100n M）处理TM3细胞24h后进行以下试验:（1）T-2毒素对TM3细胞线粒体自噬的影响:Western blot检测自噬相关蛋白LC3-II和P62的表达;透射电镜观察细胞中自噬小体的变化;将RFP-GFP-LC3转染TM3细胞检测T-2毒素对自噬流的影响;激光共聚焦显微镜观察T-2毒素对TM3细胞中线粒体与溶酶体融合的影响。（2）T-2毒素对TM3细胞线粒体损伤的影响:荧光显微镜观察细胞中ROS的变化;流式细胞仪检测TM3细胞线粒体膜电位变化;检测细胞中ATP的含量;Western blot检测线粒体动力相关蛋白1（DRP-1）在线粒体和细胞质中的表达变化;激光共聚焦显微镜观察细胞中线粒体分裂;Western blot检测线粒体分裂蛋白TFAM、DRP-1、Fis1与融合相关蛋白MFN1、MFN2的表达。（3）DRP-1介导的线粒体自噬在T-2毒素诱导TM3细胞凋亡中的作用:自噬抑制剂3-MA（5mm）预处理TM3细胞1h,T-2毒素（100 n M）作用TM3细胞24h后,Western blot检测自噬相关蛋白LC3-II和P62的表达;流式细胞仪检测线粒体膜电位变化;荧光显微镜观察细胞中ROS的变化;检测细胞中ATP的含量;激光共聚焦显微镜观察T-2毒素对TM3细胞中线粒体溶酶体融合的影响;流式细胞仪检测TM3细胞的凋亡率。用si-DRP-1转染至TM3细胞24h后,再用T-2毒素（100 n M）处理TM3细胞24h,Western blot检测DRP-1蛋白表达;流式细胞仪检测线粒体膜电位变化;荧光显微镜观察细胞中ROS含量变化;检测细胞中ATP的含量;激光微镜观察T-2毒素对TM3细胞中线粒体溶酶体融合的影响;流式细胞仪检测TM3细胞的凋亡率。结果:（1）T-2毒素呈剂量依赖性升高TM3细胞中LC3-II蛋白表达和降低P62蛋白表达;T-2毒素促进了TM3细胞中自噬小体形成,极显著增加了细胞中自噬小体自噬溶酶体的数量;极显著增加了线粒体与溶酶体的融合,促进线粒体自噬。（2）T-2毒素呈剂量依赖性极显著升高了细胞中R0S的含量和降低了线粒体膜电位与ATP的含量,诱导线粒体损伤;T-2毒素呈剂量依赖性极显著升高线粒体DRP-1蛋白的表达和降低细胞质DRP-1蛋白的表达,促进线粒体分裂,极显著增加了线粒体分裂蛋白TFAM、DRP-1和Fis1的表达,降低了融合相关蛋白MFN1和MFN2的表达。（3）添加自噬抑制剂3-MA,与T-2毒素组相比,极显著降低了TM3细胞中LC3-II蛋白的表达和增加了P62蛋白的表达,抑制自噬发生,恢复线粒体膜电位,降低细胞中ROS的含量和增加ATP的含量,减少了线粒体与溶酶体融合数量,以及TM3细胞凋亡。转染si-DRP-1,与T-2毒素相比,极显著降低了TM3细胞中D-RP1蛋白的表达,抑制线粒体分裂,恢复线粒体膜电位、降低细胞中ROS的含量和增加ATP的含量,减少线粒体与溶酶体融合数量,减少线粒体自噬,以及TM3细胞凋亡。结论:T-2毒素能够通过DRP-1介导的线粒体分裂引发线粒体自噬,进而诱导TM3细胞凋亡。
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