【摘 要】
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膜双分子层的脂质不对称是真核生物细胞膜的标志特征:磷脂酰胆碱、鞘磷脂和糖脂主要富集于细胞膜外小叶,而磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇主要在细胞膜内小叶。脂质的不对称分布对维持细胞的生物学功能至关重要,如膜稳定性、细胞形状、细胞信号传导,以及胆汁和胆固醇稳态等。为了产生和维持膜的不对称性,真核细胞表达了一系列的脂质翻转酶,包括脂质促翻酶、脂质外翻酶和脂质内翻酶。P4-ATP酶是一种脂质内翻酶,
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膜双分子层的脂质不对称是真核生物细胞膜的标志特征:磷脂酰胆碱、鞘磷脂和糖脂主要富集于细胞膜外小叶,而磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇主要在细胞膜内小叶。脂质的不对称分布对维持细胞的生物学功能至关重要,如膜稳定性、细胞形状、细胞信号传导,以及胆汁和胆固醇稳态等。为了产生和维持膜的不对称性,真核细胞表达了一系列的脂质翻转酶,包括脂质促翻酶、脂质外翻酶和脂质内翻酶。P4-ATP酶是一种脂质内翻酶,通过将磷脂从外小叶翻转到内小叶来产生和维持细胞膜脂质的不对称。ATP8B1属于P4-ATP酶家族,与CDC50A或CDC50B形成复合物以实现其正确定位并发挥功能。ATP8B1-CDC50A/B复合物与主要的胆汁酸外排泵ABCB11都定位于肝细胞的胆管细胞和小管膜,对维持膜稳态以保证ABCB11的功能具有重要作用。人ATP8B1基因位于18q21.31染色体上,在结肠、小肠、胃等组织中表达水平较高。ATP8B1的缺陷与一些严重的人类疾病相关,如Ⅰ型进行性家族性肝内胆汁淤积症和Ⅰ型良性复发性胆汁淤积症等。最近,已有一系列的P4-ATP酶（如ATP8A1与ATP11C）与CDC50A复合物的结构被解析,但P4-ATP酶与CDC50B的复合物结构仍是未知的。在HEK293F细胞中将ATP8B1分别与CDC50A和CDC50B进行共表达和纯化,成功获得了 ATP8B1-CDC50A/B的复合物。体外酶活实验发现,磷脂酰丝氨酸和磷脂酰胆碱均可以刺激ATP8B1的ATP酶活性,但磷脂酰丝氨酸的刺激更强。随后,采用冷冻电镜技术分别解析了 3.36A的ATP8B1-CDC50A、3.39A的ATP8B1-CDC50B的异源二聚体结构,以及磷脂酰丝氨酸结合状态3.98 A的ATP8B1-CDC50A复合物结构。ATP8B1主体由一个跨膜螺旋结构域（TM结构域）和三个胞内结构域（N结构域、P结构域和A结构域）组成,其中TM结构域提供底物的转运通道,N结构域结合核苷酸能够使P结构域保守的天冬氨酸磷酸化,A结构域可使P结构域去磷酸化。CDC50A/B由两个跨膜螺旋和一个高度糖基化的胞外区组成。与已知P4-ATP酶的结构比对发现,apo-form的ATP8B1处于天然的磷酸化E2P状态,且其氨基端和羧基端分别插入胞内的三个结构域之间,形成自抑制状态。进一步的酶活实验发现,胆酸盐能够进一步增强ATP8B1底物依赖的酶活,表明胆酸盐在ATP8B1的活性调控中起重要作用。结构分析发现,ATP8B1的P结构域上具有一个独特的带正电的P-loop,将其截短后,ATP8B1对胆酸盐的响应程度变弱,因此推测该P-loop参与ATP8B1对胆酸盐的响应。基于上述实验结果,我们提出了胆酸盐对ATP8B1的调控激活机制。我们的工作不仅为ATP8B1介导的胆酸循环中膜脂不对称的修复提供了结构上的支持,而且也促进了我们对P4-ATP酶的分子机制的理解。
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