【摘 要】
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伪狂犬病（Pseudorabies,PR）,即奥耶兹氏病（Aujeszky’s disease）,其病原是伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）,牛、羊、猪等多种家畜及野生动物均可患该病。PR的主要症状为发热、奇痒、脑脊髓炎、神经及繁殖系统障碍,是一种急性传染病,而且目前尚无研发出可成功治疗PR的药物,只能在临床上采用接种如PRV Bartha-K61等弱毒疫苗来对PR进行防
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伪狂犬病（Pseudorabies,PR）,即奥耶兹氏病（Aujeszky’s disease）,其病原是伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）,牛、羊、猪等多种家畜及野生动物均可患该病。PR的主要症状为发热、奇痒、脑脊髓炎、神经及繁殖系统障碍,是一种急性传染病,而且目前尚无研发出可成功治疗PR的药物,只能在临床上采用接种如PRV Bartha-K61等弱毒疫苗来对PR进行防控。但2011年后,我国多个省份中已免疫过伪狂犬疫苗的猪群中出现了新一轮PR疫情的大流行。随后许多研究也陆续证实了市场上常接种的Bartha-K61弱毒疫苗株对当前流行的PRV变异株已不能提供完全有效的保护力,这一轮以PRV流行变异株引发的PR疫情使我国的养猪业面临巨大的风险,因此一种可针对当前流行变异株的有效疫苗急待开发。本实验室于2011年从河南省南阳市某免疫过PRV Bartha-K61疫苗猪场病死猪体内分离到了一株PRV野毒株,命名为PRV NY株。基于g E、g B、g C基因的同源性和遗传进化分析结果显示,该毒株与国内近年分离的PRV流行变异株同源性最高,且在进化树中与国内近年来分离的PRV流行变异毒株位于一个分支,而与欧美经典株亲缘关系最远,这三个基因的序列也均发生了氨基酸的突变、插入或缺失。本研究以本实验室分离的PRV NY株为亲本毒株,分别扩增NY株的g E/g I基因和TK基因两侧的序列作为重组同源臂克隆至p UC-19载体,构建转移载体p UC-g E/g ILR和p UC-TKLR;再以表达绿色荧光蛋白的EGFP作为标记基因获得转移载体p UC-g E/g ILRE和p UC-TKLRE。用转移载体p UC-g E/g ILRE和PRV NY株DNA共转染ST细胞,通过空斑纯化获得表达荧光蛋白的过渡病毒r PRV NY-g E-/g I--EGFP+。再将重组病毒r PRV NY-g E-/g I--EGFP+的DNA基因组与转移载体p UC-g E/g ILR转染至ST细胞,通过空斑纯化获得去除外源EGFP基因的重组病毒r PRV NY-g E-/g I-,结合PCR扩增并测序鉴定显示缺失了2586 bp片段（含g E、g I基因）。将重组病毒r PRV NY-g E-/g I-的DNA基因组与转移载体p UC-TKLRE转染至ST细胞,通过空斑纯化获得表达荧光蛋白的三基因缺失病毒r PRV NY-g E-/g I-/TK--EGFP+,基因组PCR鉴定并测序显示缺失了TK基因311 bp的片段。本研究还对获得的双基因缺失病毒r PRV NY-g E-/g I-和三基因缺失病毒r PRV NY-g E-/g I-/TK--EGFP+进行了安全性和免疫效力的初步探究。结果显示,双基因缺失病毒r PRV NY-g E-/g I-还存有一定的毒力,对非靶动物小鼠是不安全的;而三基因缺失病毒r PRV NY-g E-/g I-/TK--EGFP+对小鼠是安全。间接ELISA试验和病毒中和试验证实r PRV NY-g E-/g I-/TK--EGFP+使小鼠机体产生了较高滴度的PRV特异性抗体,小鼠外周血T淋巴细胞亚群的测定也显示其成功激活了小鼠机体的细胞免疫,攻毒试验则表明r PRV NY-g E-/g I-/TK--EGFP+对强毒NY株的攻击具有一定的抵抗力,但免疫的剂量、免疫途径以及免疫佐剂等条件还需要进一步探索。总之,本研究获得的三基因缺失病毒r PRV NY-g E-/g I-/TK--EGFP+是一株很有希望应用于当前PRV流行防控工作的疫苗株。
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