论文部分内容阅读
目的：
力竭运动可以引起心肌能量衰竭造成心肌损伤。运动预适应可以提高心肌能量代谢水平，使心肌产生适应性，对心脏起到保护作用，其机制可能与线粒体自噬功能密切相关。在运动性心脏保护的机制中线粒体自噬AMPK-mTOR-ULK1信号通路发挥着重要的作用。本研究通过建立运动预适应SD大鼠模型，以一次性力竭运动为损伤性因素，探讨运动激活的线粒体自噬AMPK-mTOR-ULK1信号通路对力竭大鼠心脏的影响和保护机制，为运动性心脏保护的研究提供新的参考依据。
方法：
1.选用18只健康的雄性SD大鼠，随机分为安静对照组（Con组），运动预适应+力竭组(EP+EE组)，一次性力竭组（EE组），每组6只。参照Domenech和Lennon的运动负荷标准，建立运动预适应大鼠模型。除Con组以外，其余两组均进行跑台运动。EP+EE组以坡度为5°，速度为26m/min进行间歇跑台运动，运动15min，休息5min，重复3次，运动6天/周，共3周。于运动训练结束后次日与EE组以坡度为0°，速度为30m/min进行持续性跑台运动，直至大鼠力竭。Con组直接取心肌组织，EP+EE组和EE组于力竭运动后30min取材。
2.光镜下观察心肌显微结构改变；透射电镜下观察线粒体超微结构及自噬情况。
3.采用TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡情况，评估心肌细胞凋亡程度。
4.Real-time PCR技术检测大鼠心肌蛋白AMPK、ULK1、mTOR、LC3Ⅱ、Beclin1基因表达情况。
5.Western blot技术检测大鼠心肌蛋白AMPK、ULK1、mTOR、LC3Ⅱ、Beclin1、p-AMPK(Thr.172)、p-ULK1(Ser757)、p-ULK1（Ser555）、p-mTOR(Ser2448)蛋白水平表达。
结果：
1.各组大鼠心肌组织病理学观察结果
光镜下Con组心肌结构较为完整，肌纤维排列整齐，未见断裂，间质未见水肿；EE组、EP+EE组的大鼠心肌较Con组损伤性改变明显，其中EP+EE组心肌损伤较EE组减轻。
电镜下Con组心肌线粒体结构完整，线粒体嵴清晰可见，排列整齐；EE组、EP+EE组可见明显的线粒体损伤和自噬体的出现，其中EP+EE组线粒体损伤较EE组减轻，自噬体相对减少。
2.各组大鼠心肌细胞凋亡指数的比较
与Con组相比，EE组和EP+EE组的大鼠心肌凋亡指数显著升高，差别具有统计学意义（P＜0.05）；与EE组相比，EP+EE组的大鼠心肌凋亡指数降低，差别具有统计学意义（P＜0.05）。
3.Real-time PCR技术检测大鼠心肌蛋白AMPK、ULK1、mTOR、LC3Ⅱ、Beclin1基因表达情况
3.1各组大鼠心肌线粒体自噬通路相关基因mRNAAMPK、ULK1、mTOR的表达
与Con组相比，EE组和EP+EE组自噬相关蛋白AMPK、ULK1的mRNA表达均高于Con组，差别有统计学意义（P＜0.05）；EE组和EP+EE组自噬相关蛋白mTOR的mRNA表达均低于Con组，差别有统计学意义（P＜0.05）。与EE组相比，EP+EE组自噬相关蛋白AMPK、ULK1的mRNA表达较EE组降低，差别有统计学意义（P＜0.05）；EP+EE组自噬相关蛋白mTOR的mRNA表达高于EE组，差别有统计学意义（P＜0.05）。
3.2各组大鼠心肌自噬相关基因mRNA LC3Ⅱ、Beclin1的表达
与Con组相比，EE组和EP+EE组自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1的mRNA表达均高于Con组，差别有统计学意义（P＜0.05）；与EE组相比，EP+EE组LC3Ⅱ、Beclin1的mRNA表达降低，差别有统计学意义（P＜0.05）。
4.Western blot技术检测大鼠心肌蛋白AMPK、ULK1、mTOR、LC3Ⅱ、Beclin1、p-AMPK(Thr.172)、p-ULK1(Ser757)、p-ULK1（Ser555）、p-mTOR(Ser2448)蛋白水平表达
4.1各组大鼠心肌线粒体自噬通路相关蛋白AMPK、ULK1、mTOR、p-AMPK(Thr.172)、p-ULK1(Ser757)、p-ULK1（Ser555）、p-mTOR(Ser2448)的表达水平的比较
4.1.1各组大鼠心肌线粒体自噬通路相关蛋白AMPK、ULK1、mTOR含量比较
与Con组相比，EE组和EP+EE组大鼠心肌蛋白AMPK相对含量明显增加，Con组和EE组差别有统计学意义（P＜0.05），和EP+EE差别无统计学意义（P＞0.05）；与EE组相比，EP+EE组大鼠心肌蛋白中AMPK含量降低，差别有统计学意义（P＜0.05）。Con组、EE组和EP+EE组各组间心肌mTOR、ULK1蛋白含量差别无统计学意义（P＞0.05）。
4.1.2各组大鼠心肌线粒体自噬通路相关蛋白p-AMPK(Thr.172)、p-ULK1(Ser757)、p-ULK1（Ser555）、p-mTOR(Ser2448)含量比较
与Con组相比，EE组和EP+EE组大鼠心肌蛋白p-AMPK(Thr.172)、p-ULK1（Ser555）含量均明显增加，差别具有统计学意义（P＜0.05）；与EE组相比，EP+EE组心肌蛋白p-ULK1（Ser555）相对含量减少，差别有统计学意义（P＜0.05），p-AMPK(Thr.172)相对含量也减少，但差别无统计学意义（P＞0.05）。与Con组相比，EE组和EP+EE组大鼠心肌蛋白p-mTOR(Ser2448)、p-ULK1(Ser757)表达均减少，其中与EE组差别有统计学意义（P＜0.05），与EP+EE组差别无统计学意义（P＞0.05）；与EE组相比，EP+EE组心肌蛋白p-mTOR(Ser2448)、p-ULK1(Ser757)相对含量增加，差别有统计学意义（P＜0.05）。
4.2各组间线粒体自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ含量的比较
与Con组比较，EE组中大鼠心肌Beclin1、LC3Ⅱ含量显著增高，差别有统计学意义（P＜0.05），EE+EP组大鼠心肌中的Beclin1、LC3Ⅱ相对含量较高，差别无统计学意义（P＞0.05）；与EE组相比，EE+EP组大鼠心肌中的Beclin1、LC3Ⅱ相对含量降低，差别有统计学意义（P＜0.05）。
4.3线粒体自噬相关蛋白之间的相关性分析
AMPK-mTOR-ULK1信号通路蛋白与Beclin1、LC3Ⅱ成相关性。
结论：
1.力竭运动会造成心肌损伤，其机制可能与力竭运动激活的线粒体自噬AMPK-mTOR-ULK1信号通路有关，通过引起AMPK-mTOR-ULK1信号通路过度表达，线粒体自噬过度，出现自噬性凋亡。
2.运动预适应可以减轻力竭性心脏损伤，其机制可能是通过调控线粒体自噬AMPK-mTOR-ULK1信号通路，抑制AMPK-mTOR-ULK1信号通路过表达，减少细胞凋亡，发挥对心脏的保护作用。
3.过度的线粒体自噬会加重运动性心脏损伤，适度的线粒体自噬对心脏具有保护作用。
力竭运动可以引起心肌能量衰竭造成心肌损伤。运动预适应可以提高心肌能量代谢水平，使心肌产生适应性，对心脏起到保护作用，其机制可能与线粒体自噬功能密切相关。在运动性心脏保护的机制中线粒体自噬AMPK-mTOR-ULK1信号通路发挥着重要的作用。本研究通过建立运动预适应SD大鼠模型，以一次性力竭运动为损伤性因素，探讨运动激活的线粒体自噬AMPK-mTOR-ULK1信号通路对力竭大鼠心脏的影响和保护机制，为运动性心脏保护的研究提供新的参考依据。
方法：
1.选用18只健康的雄性SD大鼠，随机分为安静对照组（Con组），运动预适应+力竭组(EP+EE组)，一次性力竭组（EE组），每组6只。参照Domenech和Lennon的运动负荷标准，建立运动预适应大鼠模型。除Con组以外，其余两组均进行跑台运动。EP+EE组以坡度为5°，速度为26m/min进行间歇跑台运动，运动15min，休息5min，重复3次，运动6天/周，共3周。于运动训练结束后次日与EE组以坡度为0°，速度为30m/min进行持续性跑台运动，直至大鼠力竭。Con组直接取心肌组织，EP+EE组和EE组于力竭运动后30min取材。
2.光镜下观察心肌显微结构改变；透射电镜下观察线粒体超微结构及自噬情况。
3.采用TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡情况，评估心肌细胞凋亡程度。
4.Real-time PCR技术检测大鼠心肌蛋白AMPK、ULK1、mTOR、LC3Ⅱ、Beclin1基因表达情况。
5.Western blot技术检测大鼠心肌蛋白AMPK、ULK1、mTOR、LC3Ⅱ、Beclin1、p-AMPK(Thr.172)、p-ULK1(Ser757)、p-ULK1（Ser555）、p-mTOR(Ser2448)蛋白水平表达。
结果：
1.各组大鼠心肌组织病理学观察结果
光镜下Con组心肌结构较为完整，肌纤维排列整齐，未见断裂，间质未见水肿；EE组、EP+EE组的大鼠心肌较Con组损伤性改变明显，其中EP+EE组心肌损伤较EE组减轻。
电镜下Con组心肌线粒体结构完整，线粒体嵴清晰可见，排列整齐；EE组、EP+EE组可见明显的线粒体损伤和自噬体的出现，其中EP+EE组线粒体损伤较EE组减轻，自噬体相对减少。
2.各组大鼠心肌细胞凋亡指数的比较
与Con组相比，EE组和EP+EE组的大鼠心肌凋亡指数显著升高，差别具有统计学意义（P＜0.05）；与EE组相比，EP+EE组的大鼠心肌凋亡指数降低，差别具有统计学意义（P＜0.05）。
3.Real-time PCR技术检测大鼠心肌蛋白AMPK、ULK1、mTOR、LC3Ⅱ、Beclin1基因表达情况
3.1各组大鼠心肌线粒体自噬通路相关基因mRNAAMPK、ULK1、mTOR的表达
与Con组相比，EE组和EP+EE组自噬相关蛋白AMPK、ULK1的mRNA表达均高于Con组，差别有统计学意义（P＜0.05）；EE组和EP+EE组自噬相关蛋白mTOR的mRNA表达均低于Con组，差别有统计学意义（P＜0.05）。与EE组相比，EP+EE组自噬相关蛋白AMPK、ULK1的mRNA表达较EE组降低，差别有统计学意义（P＜0.05）；EP+EE组自噬相关蛋白mTOR的mRNA表达高于EE组，差别有统计学意义（P＜0.05）。
3.2各组大鼠心肌自噬相关基因mRNA LC3Ⅱ、Beclin1的表达
与Con组相比，EE组和EP+EE组自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1的mRNA表达均高于Con组，差别有统计学意义（P＜0.05）；与EE组相比，EP+EE组LC3Ⅱ、Beclin1的mRNA表达降低，差别有统计学意义（P＜0.05）。
4.Western blot技术检测大鼠心肌蛋白AMPK、ULK1、mTOR、LC3Ⅱ、Beclin1、p-AMPK(Thr.172)、p-ULK1(Ser757)、p-ULK1（Ser555）、p-mTOR(Ser2448)蛋白水平表达
4.1各组大鼠心肌线粒体自噬通路相关蛋白AMPK、ULK1、mTOR、p-AMPK(Thr.172)、p-ULK1(Ser757)、p-ULK1（Ser555）、p-mTOR(Ser2448)的表达水平的比较
4.1.1各组大鼠心肌线粒体自噬通路相关蛋白AMPK、ULK1、mTOR含量比较
与Con组相比，EE组和EP+EE组大鼠心肌蛋白AMPK相对含量明显增加，Con组和EE组差别有统计学意义（P＜0.05），和EP+EE差别无统计学意义（P＞0.05）；与EE组相比，EP+EE组大鼠心肌蛋白中AMPK含量降低，差别有统计学意义（P＜0.05）。Con组、EE组和EP+EE组各组间心肌mTOR、ULK1蛋白含量差别无统计学意义（P＞0.05）。
4.1.2各组大鼠心肌线粒体自噬通路相关蛋白p-AMPK(Thr.172)、p-ULK1(Ser757)、p-ULK1（Ser555）、p-mTOR(Ser2448)含量比较
与Con组相比，EE组和EP+EE组大鼠心肌蛋白p-AMPK(Thr.172)、p-ULK1（Ser555）含量均明显增加，差别具有统计学意义（P＜0.05）；与EE组相比，EP+EE组心肌蛋白p-ULK1（Ser555）相对含量减少，差别有统计学意义（P＜0.05），p-AMPK(Thr.172)相对含量也减少，但差别无统计学意义（P＞0.05）。与Con组相比，EE组和EP+EE组大鼠心肌蛋白p-mTOR(Ser2448)、p-ULK1(Ser757)表达均减少，其中与EE组差别有统计学意义（P＜0.05），与EP+EE组差别无统计学意义（P＞0.05）；与EE组相比，EP+EE组心肌蛋白p-mTOR(Ser2448)、p-ULK1(Ser757)相对含量增加，差别有统计学意义（P＜0.05）。
4.2各组间线粒体自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ含量的比较
与Con组比较，EE组中大鼠心肌Beclin1、LC3Ⅱ含量显著增高，差别有统计学意义（P＜0.05），EE+EP组大鼠心肌中的Beclin1、LC3Ⅱ相对含量较高，差别无统计学意义（P＞0.05）；与EE组相比，EE+EP组大鼠心肌中的Beclin1、LC3Ⅱ相对含量降低，差别有统计学意义（P＜0.05）。
4.3线粒体自噬相关蛋白之间的相关性分析
AMPK-mTOR-ULK1信号通路蛋白与Beclin1、LC3Ⅱ成相关性。
结论：
1.力竭运动会造成心肌损伤，其机制可能与力竭运动激活的线粒体自噬AMPK-mTOR-ULK1信号通路有关，通过引起AMPK-mTOR-ULK1信号通路过度表达，线粒体自噬过度，出现自噬性凋亡。
2.运动预适应可以减轻力竭性心脏损伤，其机制可能是通过调控线粒体自噬AMPK-mTOR-ULK1信号通路，抑制AMPK-mTOR-ULK1信号通路过表达，减少细胞凋亡，发挥对心脏的保护作用。
3.过度的线粒体自噬会加重运动性心脏损伤，适度的线粒体自噬对心脏具有保护作用。