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随着社会的发展和各方面竞争压力的增加，心理应激已成为一个不可忽视的因素威胁着人的健康。某些应激性生活事件被认为与一些消化系统最常见的慢性疾病的发病、病程进展相关，包括功能性胃肠道疾病(FGID)、炎症性肠病(IBD)、胃食管反流病(GERD)和消化性溃疡(PU)等。临床和试验研究证明：急性和慢性心理应激可以引起肠道显著的病理生理改变。然而其发病机制复杂，目前的研究尚不清楚，预防和治疗仍缺乏有效的方法。因为人类心理应激致病的发病机制、发病过程、病变程度等因人而异，治疗措施的研究受到限制，故目前关于应激相关的消化道疾病的研究更多地依赖动物实验。为了研究日常生活中的应激源促疾病效应的可能性，研究者发展了许多非创伤性的生理应激模型，冷束缚应激(cold-restrain stress，CRS)模型是一种发展成熟的心理应激方式，有明显的优点，能迅速地引起肠粘膜通透性改变，不需要外科手术和给予药物，重复性好，因此，为历来的研究者所重视。肠上皮细胞层构成机体最前沿防御屏障，具有抵御肠腔内有害微生物和潜在致病菌侵袭入外周脏器的作用。肠粘膜屏障功能下降而导致的肠腔内各种细菌、毒素及其它大分子抗原进入体内是炎症性肠病发生和恶化的一个关键性起始因素。正常情况下，肠管具有完整的屏障功能，使肠内的细菌和内毒素等物质被局限于肠腔内而不会转移到外周脏器。通透性的增加会将粘膜的免疫系统暴露在来源于肠腔食物或细菌的大量抗原中，刺激免疫兴奋，从而导致肠道的炎症的发生。研究证实，急性束缚应激能够引起上皮细胞间紧密连接松弛，肠上皮通透性增加，屏障功能受损，从而引发肠粘膜屏障功能障碍，进而引起全身多个系统的损害。因此，改善肠道的屏障功能可能是预防或改善应激诱导的肠道功能障碍的新对策，如何维护患者的肠屏障功能是目前临床研究的重点和热点问题。近年来随着微生态学理论的发展，微生态对肠屏障功能和全身免疫功能的保护作用受到关注。益生元(Prebiotics)，尤其是低聚糖类益生元作为微生态调节剂，能够通过促进肠内益生菌生长，有助于使肠内菌群恢复平衡，还可以改善肠壁的高通透性，提高肠免疫力，对维护肠屏障受损具有一定作用。在众多低聚糖中，被称为双歧杆菌生长因子的低聚半乳糖(galacto-oligosacchardes，GOS)是很有发展前景的一种，目前很多研究已成功用于治疗临床重症疾病，但对相关作用机制研究尚不清楚。本部分研究主要观察了加入GOS益生元后，重点从对粘膜机械性屏障的作用来研究该微生态制剂对CRS大鼠肠屏障保护作用及其作用机制。全文分为3部分进行研究。1、CRS大鼠动物模型的建立实验前大鼠禁食24小时，自由饮水。在乙醚轻度麻醉下，将大鼠置于大鼠固定器中，限制其活动，置于4度冰箱，束缚3个小时。HE染色观察，模型诱发后，肠粘膜病理损害明显：肠粘膜变薄、萎缩，粘膜浅层有部分坏死，上皮细胞脱落，部分绒毛顶端固有层有明显充血水肿，肠粘膜上皮细胞与固有层间距离增宽等。没有模型大鼠死亡，该方法可以成功建立应激动物模型，能迅速引起肠道粘膜通透性改变，重复性好。2、益生元对CRS大鼠肠屏障通透性和机械屏障改变的影响2．1益生元对CRS大鼠肠屏障通透性影响Wistar大鼠随机分为四组：A组：对照组(基础饮食／假应激)，B组：益生元+假应激，C组：基础饮食+CRS，以及D组：益生元+CRS。各CRS模型组的血浆二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)活性显著高于对照组，提示CRS应激时，肠粘膜细胞有损伤、坏死，DAO进入外周血导致血浆DAO活性增高；C组(基础饮食+CRS)活性显著高于D组(GOS+CRS)，说明添加GOS虽然不能完全逆转CRS时肠粘膜损伤，但可以减轻肠粘膜受损的程度，降低血浆DAO水平。2．2益生元对小肠粘膜机械屏障改变的影响肠粘膜原位细胞凋亡的检测结果显示，各CRS组的凋亡指数(apoptosis index，AI)显著高于对照组，说明正常大鼠的肠上皮存在自发的凋亡现象，而CRS大鼠肠上皮凋亡明显增加，添加益生元GOS的D组的AI显著低于未添加GOS的C组，说明添加GOS有助于减少小肠粘膜上皮细胞凋亡的发生，有利于维持肠粘膜机械屏障。3、益生元对大鼠肠上皮细胞间紧密连接结合蛋白的作用机制采用免疫组化检测小肠上皮细胞间紧密连接结合蛋白occludin蛋白的表达水平，结果显示：各CRS组occludin蛋白表达显著低于对照组，添加益生元GOS的D组表达水平显著低于未添加GOS的C组，A组和添加GOS的B组大鼠肠上皮细胞间紧密连接蛋白occludin蛋白的表达水平的差异没有统计学意义。实时荧光定量PCR检测occludinmRNA水平，各CRS组occludin mRNA表达显著低于对照组，未添加GOS的C组表达水平显著低于添加益生元GOS的D组，A组和添加GOS的B组大鼠肠上皮细胞间紧密连接蛋白occludin mRNA的表达水平的差异没有统计学意义。添加GOS可以增加occludin蛋白表达和mRNA水平，可能是其改善紧密连接和维护肠屏障功能的机制之一，这种蛋白的表达增强作用可能在转录环节发生。