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本课题通过实时定量PCR（qPCR）、Western blot以及染色质免疫沉淀（Ch Ip）等实验方法,对泛素E3连接酶Itch在骨折修复过程中的作用进行相关研究。制作小鼠胫骨骨折模型是试验中重要的一环:通过腹腔注射适量的氯胺酮和甲苯噻嗪对小鼠进行麻醉;在确认麻醉诱导生效后,将左膝和小腿的毛剃除干净充分备皮;使用聚维酮碘溶液对术区进行消毒;使用无菌手术刀在小鼠胫骨前侧皮肤上做长约6mm的纵行切口,同时将其膝关节尽可能弯曲到约120度;将无菌的27G针头通过胫骨内、外侧髁之间的髌韧带插入胫骨髓腔中,并确认针的尖端到达髓腔的末端;将针头临时向后稍拔出,以便于使用Dremel 7700电磨钻横断胫骨;然后将针重新插入胫骨髓腔将骨折固定复位;切口用5-0缝线妥善缝合;当小鼠仍处于麻醉状态时进行X线成像以确认针头放置。在骨折术后第3、7、10、14和21使用TRIzol试剂从骨痂组织提取总RNA。使用i SCRIPT c DNA合成试剂盒合成c DNA。在i Cycler实时PCR仪中使用i Q SYBR Green Supermix根据制造商的说明进行实时定量RT-PCR扩增。在相同的平板上扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）,并用于标准化数据。每个样品一式三份制备并且重复至少一次。通过从GAPDH（ΔCT）的相应CT值中减去各个基因的每个样品的周期阈值（CT）来计算每个基因的相对丰度。ΔΔCT通过减去参考点的ΔCT获得。然后将这些值提高至2（2ΔΔCT）的乘方,以产生相对于参考点的表达水平。为了证实泛素E3连接酶是否参与骨折修复的过程,我们通过qPCR检测了在接受胫骨骨折手术的3个月龄大的WT C57BL/6J小鼠的骨痂组织中泛素E3连接酶的多个Nedd4亚类的表达水平:从骨折后7天开始,Wwp1,Smurf1,Smurf2和Itch的表达水平均显着增加,并在骨折后10天达到峰值（Itch表达水平在骨折后14天达到峰值）。我们还通过qPCR检测了骨折后不同时间点从骨痂组织提取的RNA中NF-κB成员的表达水平。包括p50,Rel A,p52和Rel B在内的所有NF-κB成员的表达水平从骨折后第7天开始显著增加并在骨折后14天达到峰值,这也和泛素E3连接酶表达水平增高的时间点相似。我们想探究在骨痂组织中总泛素化蛋白的表达量在蛋白酶体抑制剂MG132的作用下是否增加。为了检测总泛素化蛋白的表达水平,在骨折术后第7天处死WT小鼠且于24小时之前腹腔内注射蛋白酶体抑制剂MG132（1mg/kg）。通过Western blot对骨痂组织总蛋白进行检测,来自非骨折侧胫骨的皮质骨将被用作对照。从骨折处骨痂组织制备全细胞裂解物。使用含有蛋白酶抑制剂混合物的哺乳动物蛋白质提取试剂裂解具有液氮的均质化骨折处骨痂或细胞。将全细胞裂解物装载在10%十二烷基硫酸钠（SDS）-PAGE凝胶中,转移至硝酸纤维素膜,并用β-actin、泛素的相应抗体进行免疫印迹。使用ECL化学发光显现条带。与非骨折侧胫骨皮质骨组织相比,骨折一侧的胫骨骨痂组织中的总泛素化蛋白的表达量增加。我们已经证实NF-κB家族的Rel A介导的NF-κB受体激动剂（RANKL）通过直接结合Itch启动子中的NF-κB位点从而在破骨细胞中诱导Itch表达。我们想探究这是否也同样发生在成骨细胞。此前我们也已经使用TFSEARCH软件（version 1.3,用于推测转录因子结合位点的免费软件并且可从http://www.cbrc.jp/htbin/bgettfmatrix?M00022获得）在小鼠Itch启动子（NCBI Ref Seq登录号NC000068）的-3473/-3465和-3183/-3175位置鉴定了两个推定的NF-κB结合位点。我们在C2C12细胞中过表达Rel A和Rel B,发现他们可以增加Itch的表达水平。为了证实NF-κB是否通过结合到Itch启动子促进成骨细胞中的Itch表达,我们选择成骨细胞/成肌细胞前体细胞系C2C12细胞。C2C12细胞用编码绿色荧光蛋白（GFP）对照并且用编码NF-κB Rel A或Rel B的逆转录病毒感染24小时。通过荧光显微镜确认感染效率。根据制造商的说明下使用MAGnify染色质免疫沉淀系统进行Ch IP测定。将1×106个细胞用甲醛固定10分钟。然后将细胞在含有蛋白酶抑制剂的50μl裂解缓冲液（lysis buffer）中裂解,并使用Bioruptor UCD-200超声破碎仪高功率下在冰上每次20秒开、20秒关超声处理8次从而将染色质剪切成200-500 bp的片段。用稀释缓冲液将染色质按照1:10的比例稀释。取10μl用作Input。在免疫沉淀步骤中使用针对Rel A和Rel B或对照兔Ig G的抗体。将抗体偶联至Dynabeads,然后与稀释的染色质在4℃孵育2小时。在充分洗涤后,免疫沉淀（IP）染色质在含有蛋白酶K的交联缓冲液中在55℃下逆转交联15分钟。使用位于结合位点的引物通过定量PCR测定纯化的DNA片段。将位于不相关下游位点的对照引物用作阴性对照。通过使用抗NF-κB Rel A和Rel B的抗体进行Ch IP测定并捕获蛋白质-染色质复合物和邻近这些NF-κB结合位点的两个引物。结果表明Rel A和Rel B结合到Itch启动子的NF-κB结合位点。Itch作为一种泛素E3连接酶,可以促进包括成骨细胞正性调控因子等靶蛋白的泛素化,从而负性调节成骨细胞的分化。因此,在没有Itch参与的情况下成骨细胞的分化应该增加。Itch KO小鼠是通过C57BL/6J的杂合雌性小鼠与杂合雄性小鼠繁殖而产生的。通过聚合酶链反应（PCR）对Itch缺陷的纯合小鼠（Itch KO小鼠）进行基因分型。在骨折术后第3、7、10、14和21天使用TRIzol试剂从骨痂组织提取总RNA。在相同的平板上扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）,并用于标准化数据。每个样品一式三份制备并且重复至少一次。为了确定在骨折部位是否存在这种情况,我们在Itch KO小鼠的骨折处骨痂组织中于不同的时间点分别测定了成骨细胞相关基因（Runx2,ALP）和与骨重建相关的基因（RANKL,OPG）的表达水平。Runx2和ALP是两种成骨细胞的正性调控因子,通过成骨细胞中的泛素化和蛋白酶体降解从而被调控。RANKL和OPG在破骨细胞形成和骨重建中起关键作用。从骨折后第7天开始,Itch KO小鼠骨痂中的ALP和Runx2的表达水平同WT小鼠相比显着增加（与WT相比）。RANKL/OPG的比值没有改变,尽管它们的表达水平在Itch KO小鼠的骨痂中表达水平也是增加的。此本课题中,我们通过WT小鼠和Itch KO小鼠研究了泛素E3连接酶Itch在骨折修复过程中的潜在作用。实验结果充分证实包括Itch在内的含有WW结构域的泛素E3连接酶,在骨折修复的早期阶段表达水平增高,并且泛素化蛋白的表达水平也增高;增高的Itch表达水平与NF-κB成员的表达水平增加是相关的;NF-κB通过结合成骨细胞祖细胞系中Itch启动子中的NF-κB结合位点来上调Itch的表达水平;来自Itch KO小鼠骨痂组织的成骨细胞正性调控因子表达水平明显增高。这些结果首次表明了泛素-蛋白酶体系统可能参与骨折修复过程。我们的研究结果表明,Itch消除可能对骨痂中的成骨细胞分化具有强烈的积极影响。因此,泛素E3连接酶Itch可能是促进骨折愈合的潜在靶标。