【摘 要】
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胶原蛋白是组成骨有机基质的重要部分,其水解产物胶原多肽具备抗氧化、抗衰老以及抗骨质疏松等生理活性。本文利用副产物向海鸿雁骨为原料制备胶原多肽,研究了鸿雁骨胶原多肽的制备工艺,对其基本性质进行分析,并探究了鸿雁骨胶原多肽的抗氧化性以及促进成骨细胞增殖分化活性,以期为雁骨及其相关产品的研究开发提供技术参数指导,取得实验成果如下:(1)分析了鸿雁骨的基本成分,其中蛋白质的含量高达46.72%。实验确定复
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胶原蛋白是组成骨有机基质的重要部分,其水解产物胶原多肽具备抗氧化、抗衰老以及抗骨质疏松等生理活性。本文利用副产物向海鸿雁骨为原料制备胶原多肽,研究了鸿雁骨胶原多肽的制备工艺,对其基本性质进行分析,并探究了鸿雁骨胶原多肽的抗氧化性以及促进成骨细胞增殖分化活性,以期为雁骨及其相关产品的研究开发提供技术参数指导,取得实验成果如下:(1)分析了鸿雁骨的基本成分,其中蛋白质的含量高达46.72%。实验确定复合酶(木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶质量比为1:2:1)作为工具酶,通过单因素实验和响应面实验研究并优化酶解工艺,得到最佳酶解工艺参数为:在温度为50.4℃、p H值为7.1、加酶量为6100 U/g的条件下水解5 h,水解度最高达到26.34%。在最优条件下酶解鸿雁骨制备骨胶原多肽(Bone collagen peptides,BCP),并采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和分子排阻色谱法测定骨胶原多肽的分子量范围为851~11092 Da。通过超滤膜法对经复合酶在最优条件下酶解制备的鸿雁骨胶原多肽进行分级分离,分别得到分子量为5~10 k Da、3~5 k Da和小于3 k Da的三个多肽组分BCP1、BCP2、BCP3,三个组分占多肽总质量的97.82%。通过对鸿雁骨胶原多肽氨基酸检测分析发现,甘氨酸的含量最多达到27.7%,且脯氨酸、羟脯氨酸以及丙氨酸的含量也较为丰富。(2)通过对鸿雁骨胶原多肽及其分级分离后各组分的还原力,以及对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率测定,发现鸿雁骨胶原多肽及其分级分离的各多肽组分均表现出较强的抗氧化性,且分离后的多肽组分的抗氧化能力更强。当样品质量浓度相同时,各组分的抗氧化能力大小为BCP3>BCP2>BCP1>BCP,BCP3(<3 k Da)多肽组分的抗氧化能力最强。当鸿雁骨胶原多肽BCP3组分的质量浓度为12 mg/m L时,还原力测定A700 nm值为0.915,对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟自由基的清除率分别为89.23%、90.67%、88.17%,表现出较强的抗氧化性。(3)通过MC3T3-E1细胞增殖和碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性的测定实验,发现鸿雁骨胶原多肽及各分离多肽组分均能促进成骨细胞的增殖与分化,且分级分离后的多肽组分对成骨细胞的增殖分化的促进效果更好。当给药浓度为100μg/m L时,各组分对成骨细胞的增殖分化具有良好的促进作用,其中分子量组成最小的BCP3(<3 k Da)多肽组分的促进效果最好。当给药BCP3组分100μg/m L培养72小时,成骨细胞增殖率为57.14%;给药培养7天时,ALP活力增加了15.90%。
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