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藜麦(Chenopodium quinoa.Wild)是盐生植物,因其独特的生物学特性及全面的营养价值逐渐成为越来越多生物学家的研究对象。随着藜麦全基因组序列信息的解析,越来越多藜麦功能基因逐渐被克隆,但用于藜麦的CRISPR/Cas9基因组编辑体系还未见报道,这一定程度上限制了藜麦的基因功能研究。乙酰-5-羟色胺甲基转移酶(Acetylserotonin methyltransferase,ASMT)是褪黑素生物合成的最后一种酶,在植物褪黑激素的产生中起着限速作用,编码ASMT蛋白的基因通常以多基因家族的形式存在,近年来越来越多研究表明,提高ASMT基因的表达水平可以提高植物对逆境抗性,但ASMT基因突变后的表型及生理影响还不清楚。为此,本研究开展了三部分的工作,首先对藜麦原生质体瞬时表达的条件进行了摸索确定,为筛选构建藜麦CRISPR/Cas9系统所需的U6启动子奠定基础;其次,对藜麦不同U6启动子进行克隆,构建表达载体筛选高转录活性的藜麦U6启动子;最后对藜麦ASMT基因家族进行系统分析,确定了ASMT靶标基因,并利用筛选得到的U6启动子构建藜麦ASMT基因的CRISPR/Cas9靶向编辑载体。主要研究结果如下:(1)藜麦原生质体瞬时转化系统的建立采用正交法确定藜麦原生质体瞬时表达体系的条件,结果表明,以藜麦幼嫩叶片为材料,以含有1.5%纤维素酶、0.3%离析酶以及0.6M甘露醇的MES溶液作为酶解液酶解8小时,150g离心10min收集原生质体,得到的原生质体数量最多,原生质体形态饱满,原生质体活力较高,适用于原生质体的后续操作。以含有30%PEG4000的转化液转化原生质体15分钟,转化效率最高。(2)藜麦不同U6启动子的克隆及功能分析根据已经公布的藜麦参考基因组信息,通过同源比对的方法筛选到5个藜麦U6snDNA,以其上游序列为参照,分别设计引物将其克隆出来并构建到pSCZ3的启动子区域,以优化好的原生质体转化条件对五个载体进行转化,荧光显微镜观察并统计转化效率。结果表明5个藜麦U6启动子均含有保守的上游顺式作用元件,其中CqU6-3P启动子转录活性最高,可用于藜麦CRISPR/Cas9基因编辑体系中sgRNA的转录。(3)CqASMT12基因CRISPR/Cas9靶向编辑载体的构建为确定ASMT靶标基因,通过同源比对方法对藜麦全基因组内含有ASMT结构域的序列进行分析。结果表明,藜麦中含有49个ASMT家族基因成员,蛋白质序列长度分布在224-639氨基酸之间,具有0-6个内含子,基因家族可能因为串联复制而扩大。RNA-seq结果表明,CqASMT6、CqASMT12、CqASMT20和CqASMT25四个基因在藜麦不同组织中呈组成型表达。选取CqASMT12为靶基因,以pCAMBIA3301为背景载体,将其原有的35S启动子替换为pYAO启动子,并将藜麦内源CqU6-3P启动子驱动的sgRNA表达盒构建到特定位置,命名为pCAMBIA3301-pYAO-Cas9。琼脂糖凝胶电泳及测序结果表明,pCAMBIA3301-pYAO-Cas9构建成功。