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研究目的格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome,GBS)是引起迟缓性麻痹的主要疾病,是外周神经的炎症性脱髓鞘疾病。实验性自身免疫性神经炎(experimental autoimmune neuritis,EAN)是CD4~+ T细胞介导的外周神经自身免疫性脱髓鞘疾病,其临床经过、神经电生理检查及病理学改变与GBS最常见的临床亚型-急性炎症性脱髓鞘性多发神经炎(acute inflammation demyelinative polyradiculoneuropathy,AIDP)极为相似,是公认的研究GBS的经典动物模型。目前,GBS的治疗主要是血浆置换或静脉注射丙种球蛋白,虽然其能缩短病程,加快病情恢复,但仍有大约5%病死率,20%的患者遗留永久性残疾。多数学者认为,糖皮质激素等免疫抑制剂的对本病无效。因此,有必要探讨治疗GBS的新方法。脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)是一种19碳类固醇,是雌激素和雄激素的前体物质,也是目前尚不明确的多种免疫调节性类固醇的前体物质。体内、外研究证实DHEA及其代谢产物具有抗炎、抗增殖和免疫调节活性,对人和动物的免疫系统可产生有益的作用。EAN是Th1细胞介导的外周神经自身免疫性脱髓鞘疾病,神经内膜下T淋巴细胞、巨噬细胞浸润及多灶性、节段性髓鞘脱失为主要病理改变,促炎性细胞因子(如IFN-γ、TNF-α、IL-12、NO等)在其发病机制中起关键作用。目前国内外尚未见有应用DHEA治疗EAN的报道,基于以往体内外研究证实的DHEA对免疫系统的作用,我们应用DHEA治疗发病初期EAN,通过观察EAN的临床、病理及免疫指标,评价DHEA对发病初期EAN的治疗作用并探讨其免疫保护机制。方法1.抗原:采用超速离心法自牛脊神经根提取周围神经髓磷脂(bovine peripheral nerve myelin,BPM)。2.实验动物:6-8周龄雌性Lewis大鼠36只,体重150-170g,SPF级饲养。3.EAN模型的建立及临床评分:大鼠经适应性饲养一周,氯胺酮(10mg/Kg)麻醉。将100μl抗原乳剂(含BPM 5mg、结核杆菌1mg、不完全弗氏佐剂50μl、生理盐水50μl)注入双侧后肢足垫皮下。于免疫前即时及免疫后每日进行临床评估,直至免疫后28天。临床评分:0:正常;0.5:全尾肌张力下降;1.0:尾部肌肉瘫,松软拖地;1.5:轻微后肢无力,肌张力下降;2.0:明显后肢无力或轻度后肢瘫;2.5:中度后肢瘫;3.0:严重后肢瘫;4:严重四肢瘫。4.脱氢表雄酮(DHEA)治疗:将大鼠随机分为DHEA 0.5mg/剂治疗组、2mg/剂治疗组和对照组,每组各12只。治疗组于免疫后第5天开始皮下注射DHEA,体积50μl,每日一次,至免疫后28天。对照组皮下注射相同体积的DHEA溶媒二甲基亚砜(DMSO)。5.组织病理学检查:于免疫后16天处死大鼠,每组各7只,取坐骨神经近脊髓段,10%福尔马林固定,石蜡包埋,纵行切片(5-6μm,每根神经2张连续切片),HE染色,应用计算机图像分析系统40倍物镜下采集图像,每张切片随机取5个视野,计数坐骨神经中浸润的单个核细胞,取其平均值,结果以细胞数/mm~2组织表示。6.免疫组化检测:大鼠坐骨神经石蜡切片,常规脱蜡致水,经阻断内源性过氧化物酶活性、抗原修复、牛血清白蛋白封闭处理,分别滴加一抗(山羊抗大鼠IFN-γ、TNF-α多克隆抗体)和二抗(辣根过氧化酶标记兔抗山羊IgG),DAB显色,苏木苏复染,脱水,透明,封固。40倍物镜下采集图像,观察大鼠坐骨神经中细胞阳性反应,结果以细胞数/mm~2组织表示。7.单个核细胞体外增殖试验:取免疫后16天EAN大鼠腹股沟淋巴结和脾脏制备单个细胞悬液(2×10~6/ml),悬浮于RPMI1640培养基,接种到96孔培养板,分别加入10μl BPM、植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)和磷酸盐缓冲溶液(phosphate bufferedsolution,PBS)培养48小时,再加入~3H-甲基胸腺嘧啶脱氧核苷1μCi/孔,18小时后收集细胞,β-液体闪烁仪检测测定胸腺嘧啶核苷结合量,结果以每分钟放射性荧光闪烁计数值(cpm)表示。8.单个核细胞培养上清液细胞因子检测:来自引流淋巴结和脾脏的单个核细胞悬液(2×10~6/ml),加入BPM(终浓度20μg/ml),培养48小时,收获上清液。应用酶联免疫分析试剂盒检测TNF-α、IFN-γ、IL-10,操作按说明书步骤进行。标准品和样本均设双复孔,结果以pg/ml表示。9.统计学方法:应用SPSS 13.0软件对资料进行统计分析,数据以(?)±s表示。应用单因素方差分析或秩和检验(Kruskal-Wallis检验法)进行组间比较,组间差异有统计学意义则用SNK法或Bonferroni法进行组间两两比较,P＜0.05为差别有统计学意义。结果1.DHEA延迟EAN发病时间:三组大鼠在发病时间上表现出明显差异,DHEA 2mg治疗组发病时间为11.83±0.94天,0.5mg治疗组为10.92±1.08天,对照组为9.17±0.94天。与对照组比较,两种剂量DHEA治疗组发病时间均延迟(P＜0.05,P＜0.05),DHEA 2mg治疗组与0.5mg治疗组比较发病时间亦明显延迟(P＜0.05)。2.DHEA降低EAN高峰期临床评分:疾病高峰期(免疫后第16d)临床评分显示DHEA 2mg治疗组为1.42±0.73,0.5mg治疗组为2.00±0.56,对照组为2.29±0.62。与对照组比较,DHEA 2mg治疗组疾病高峰期临床评分明显降低(P＜0.05)。DHEA 2mg治疗组疾病高峰期临床评分明显低于0.5mg治疗组(P＜0.05)。0.5mg治疗组疾病高峰期评分低于对照组,但经统计学处理无显著差异。3.DHEA减少炎性细胞在外周神经浸润:疾病高峰期大鼠坐骨神经组织病理学检查结果显示,DHEA 2mg治疗组骨神经中炎性细胞浸润数目为37.00±29.59个/mm~2组织,0.5mg治疗组为62.00±37.11/mm~2组织,对照组为105.50±31.05/mm~2组织。与对照组比较,DHEA 2mg治疗组和0.5mg治疗组坐骨神经中炎性细胞浸润数目均明显减少(P＜0.05,P＜0.05)。DHEA 2mg治疗组炎性细胞浸润数目较0.5mg治疗组减少,但经统计学处理无意义。4.DHEA抑制脾脏单个核细胞增殖反应:于EAN高峰期高峰期检测大鼠引流淋巴结和脾脏单个核细胞体外增殖,BPM、PHA诱导的和无抗原刺激(PBS)组单个核细胞增殖(cpm)分别为:DHEA 2mg治疗组2900±672、4500±1581和594±220;0.5mg治疗组5125±1433、6562±1720和1150±160;对照组9125±1941、11680±2344和1338±358。结果显示,与对照组比较两种剂量DHEA治疗组均能明显抑制BPM和PHA诱导的单个核细胞增殖(P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05);与对照组比较,DHEA 2mg治疗组对无抗原刺激组(PBS)单个核细胞增殖有明显抑制作用(P＜0.05),0.5mg治疗组与对照组比较差异无统计学意义。5.DHEA减少外周神经促炎细胞因子产生:应用免疫组化技术检测疾病高峰期大鼠坐骨神经中IFN-γ、TNF-α表达,结果显示IFN-γ、TNF-α阳性反应细胞数分别为:DHEA 2mg治疗组17.50±13.03个/mm~2组织、13.63±10.03个/mm~2组织,0.5mg治疗组25.75±13.78个/mm~2组织、20.50±11.41个/mm~2组织,对照组64.88±23.22个/mm~2组织、47.00±16.63个/mm~2组织。与对照组比较,DHEA 2mg治疗组和0.5mg治疗组IFN-γ、TNF-α阳性反应细胞数均明显减少(P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05),DHEA 2mg治疗组与0.5mg治疗组比较IFN-γ、TNF-α阳性反应细胞数未见明显差异。6.DHEA影响单个核细胞培养上清液细胞因子水平:应用酶联免疫吸附法检测引流淋巴结和脾脏单个核细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α、IL-10水平,结果显示DHEA 2mg治疗组分别为143.13±43.17 pg/ml、90.00±29.76 pg/ml、70.13±26.22 pg/ml;0.5mg治疗组分别为213.75±44.06 pg/ml、119.38±19.35 pg/ml、46.00±12.62 pg/ml,对照组为365.00±63.70 pg/ml、176.25±28.75 pg/ml、48.36±16.34pg/ml。与对照组比较,DHEA 2 mg治疗组和0.5 mg治疗组均能减少IFN-γ和TNF-α生成(P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05),DHEA2 mg治疗组IFN-γ和TNF-α水平较0.5 mg治疗组降低(P＜0.05,P＜0.05);各组间IL-10水平未显示明显的差异。结论1.应用两种剂量脱氢表雄酮(DHEA)治疗发病初期EAN,与对照组比较,可明显延缓发病时间,降低疾病高峰期临床评分,减少坐骨神经中炎性细胞浸润数目,提示DHEA对外周神经自身免疫性疾病有治疗作用。2.应用两种剂量DHEA治疗发病初期EAN,与对照组比较,可明显抑制BPM诱导的单个核细胞增殖,减少坐骨神经中IFN-γ、TNF-α阳性反应细胞数目,降低BPM刺激的单个核细胞培养上清中IFN-γ、TNF-α水平。提示DHEA可抑制EAN大鼠自身反应性T淋巴细胞增殖和促炎性细胞因子过度表达,抑制细胞免疫反应。3.DHEA可降低全身和病灶局部IFN-γ、TNF-α水平,对IL-10产生无影响。表明DHEA对EAN的治疗作用主要是下调Thl1反应,抑制促炎性细胞因子过度分泌,对Th2细胞因子水平无影响。4.与0.5mg/剂治疗组比较,2mg/剂治疗组能明显延缓EAN发病时间,降低疾病高峰期临床评分,减少单个核细胞培养上清IFN-γ、TNF-α产生,提示DHEA疗效的剂量相关性。研究意义格林-巴利综合征(GBS)引起急性迟缓性麻痹最常见的原因,是外周神经的自身免疫性炎症性脱髓鞘疾病。目前,血浆置换或静脉注射丙种球蛋白是治疗GBS的主要方法,其能缩短病程,加快恢复,但临床上仍有大约5%的病死率,大约20%的患者遗留永久性残疾。因此,有必要研究尝试新的治疗方法,阻断炎症级联反应,降低本病的死亡率及神经系统后遗症的发生率。脱氢表雄酮(DHEA)是人类循环中最丰富的肾上腺皮质类固醇,体内、外研究证实DHEA及其代谢产物具有抗炎、抗增殖和免疫调节活性,对人和动物的免疫系统可产生有益的作用。实验性自身免疫性神经炎(EAN)是GBS最常见的临床亚型急性炎症性脱髓鞘性多发神经炎(AIDP)的经典动物模型,本课题应用DHEA治疗发病初期EAN,通过观察EAN的临床和病理及免疫指标的改变,评价DHEA对发病初期EAN的治疗作用并探讨其免疫机制,为探索治疗自身免疫性疾病的新模式提供了依据。创新性1.本课题应用牛周围神经髓磷脂与完全弗氏佐剂混合制成抗原乳剂,注入易感鼠种Lewis大鼠双后肢足垫皮下,诱导实验性自身免疫性神经炎(EAN)动物模型。该模型是GBS最常见的临床亚型AIDP的经典动物模型,目前国内未见有应用上述方法及鼠种诱导EAN的报道。2.本课题应用脱氢表雄酮(DHEA)治疗发病初期EAN,观察比较临床评分、坐骨神经炎性细胞浸润,评价DHEA的治疗效果。通过观察DHEA对引流淋巴结和脾脏单个核细胞体外增殖、培养上清IFN-γ、TNF-α、IL-10水平及坐骨神经中IFN-γ、TNF-α表达水平的影响,探讨其免疫治疗机制。目前国内外尚未见DHEA治疗EAN及其机制的研究报道。