选题依据:近年来研究表明柴胡具有保肝、解热、抗炎等多种药理活性。关于柴胡皂苷药代动力学和体内代谢过程的研究虽然很多,但是多数针对柴胡皂苷单个化合物,体现不出中医理论的整体性,关于体内组织分布的研究匮乏,仅发现柴胡皂苷d的研究,故本研究对柴胡药代动力学及组织分布进行更加全面深入研究。中药煎煮是传统用药和临床用药的主要方式,随着中药材现代研究手段的增多,有越来越多的工艺选择了醇提方式。传统中医理论认为药材水煎能够促进其在体内的吸收,最大限度发挥药效,现代研究认为药材醇提后能够得到更多有效成分,利于药效发挥。那么这两种不同提取方式对柴胡的化学成分和体内过程有什么影响呢,尚不清楚,故本研究比较了醇提和水煎后柴胡在体内外成分种类和数量的差异,并对两种提取方式进行柴胡药代动力学研究。中药材除单味药材制剂外,更多通过配伍后以方剂形式使用,柴胡有很多应用广泛的方剂如逍遥散,小柴胡汤等,柴胡-白芍药对是出自《太平惠民和剂局方》,临床应用历史悠久,与白芍配伍对柴胡在体内的影响尚不清楚,本文通过柴胡与白芍配伍前后水煎液中主要成分的药代动力学和组织分布研究,对白芍对柴胡在体内的影响进行初探。通过这一系列研究为柴胡临床用药和新药研发提供基础和依据。目的:首先,对柴胡中化学成分进行全面分析,并比较三种样品(柴胡醇提物、柴胡水煎液、柴胡+白芍水煎液)中化学成分种类和数量差异;其次,基于代谢组学方法筛选柴胡药代动力学指标成分,对指标成分进行定量分析,并比较三种样品间含量差异;再次,对柴胡药代动力学及组织分布进行探究,并比较不同提取方法、配伍对柴胡药代动力学及组织分布的影响。为临床合理用药及柴胡相关新药研发提供科学依据。方法:1.建立柴胡中化学成分定性分析的UPLC-MS方法。色谱条件:BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm);流动相为0.1%甲酸水(A)-乙腈(B);梯度洗脱:0～30 min,10%～60%B;30～40 min,60%～90%B;40～45 min,90%B;体积流量 0.3mL/min;柱温 35℃;质谱条件:ESI 源:+3.0KV/-2.7KV;Sheath Gas Pressure:35arb;Aux Gas Pressure:10arb;Capillary Temp:300℃;Heater Temp:300℃;Scan mode:Full MS(Resolution 70000)and dd-MS2(Resolution 17500,NCE 25,Stepped NCE 50%);Scan range:m/z 150～2000。2.对柴胡醇提物给药前后的大鼠血清进行UPLC-MS分析,结合代谢组学、PCA、OPLS-DA分析找出柴胡药代动力学指标成分,色谱条件与质谱条件同1。3.建立柴胡中指标成分SSa、SSc、SSd、SSb1、SSb2的UPLC含量测定方法,并应用于柴胡醇提物、柴胡水煎液、柴胡+白芍水煎液。色谱柱:BEHC18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm);流动相:水(A)-乙腈(B),梯度洗脱:0～6min,30%B;6～10min,30～37%B;10～17min,37%B;17～23min,37%～90%B;23～25min,90%～90%B;体积流量0.3mL/min;柱温35℃;PDA全波长扫描。4.建立血清中指标成分的UPLC-MS含量测定方法,并应用于药代动力学研究;同时对血清中其它原型成分进行半定量分析,便于全面了解柴胡在机体内行为。选用雄性SD大鼠,随机分为3组,分别灌胃给予大鼠柴胡醇提物、柴胡水煎液、柴胡+白芍水煎液,分别于给药前及给药后0.083 h,0.25 h,0.5 h,0.75 h,1h,1.5h,3h,5h,8h,12h经眼眶取血约0.5mL,测定血药浓度,绘制药-时曲线,计算药动学参数。5.建立组织中药代指标成分SSa、SSc、SSd、SSb1、SSb2UPLC-MS含量测定方法,并应用于组织分布研究。选用SD大鼠,随机分为3组,分别灌胃给予大鼠柴胡醇提物、柴胡+白芍水煎液、柴胡水煎液,给药后0.25 h、0.5 h、0.75 h、3 h、5h处死取心、肝、脾、肺、肾组织,样品经预处理后,采用上述方法测定组织中各皂苷类成分的含量,完成组织分布研究。结果:1.对柴胡的主要化学成分进行UPLC-MS分析,总结皂苷类成分裂解规律,检测鉴定出柴胡皂苷类成分23种。比较三种样品中成分,结果显示柴胡醇提物中成分种类和数量多于水煎液,但是SSb1和SSb2水煎液中略多;与白芍配伍前后无明显差异。2.UPLC-MS分析灌胃给予柴胡醇提物前后血清,通过代谢组学方法筛选出5种VIP值较大的药材原型成分:SSa、SSc、SSd、SSbi、SSb2,将其作为柴胡药代动力学指标成分。3.建立了5种皂苷类指标成分的UPLC含量测定方法,测定了柴胡不同提取方法下的样品(水煎液和醇提物)中皂苷类成分的含量,结果表明:醇提物中的SSa、SSd的含量明显高于水煎液中,水煎液中的SSb1和SSb2含量明显升高。本方法稳定,快速,方便,便于推广,为柴胡的质量控制提供了基础。4.在药代动力学实验中,得到了各成分血药浓度、药-时曲线图、药动学参数,结果显示各成分的Tmax在0.5 h左右,t1/2在1.5 h左右,Vz/F远大于0.67 L/kg(大鼠体液体积),表明柴胡皂苷类成分具有吸收快、消除快、分布广的特点;柴胡水煎液与柴胡醇提物组相比较,各成分的消除变缓;与白芍配伍后,各成分的吸收变缓,消除加快。5.组织分布实验中,本研究测定的5种柴胡皂苷类成分组织分布存在一定相似性。灌胃给予大鼠柴胡醇提物后,SSa、SSd、SSc、SSb1、SSb2在肺、肝中的分布量较大,表明与肺、肝组织的亲和力较强。灌胃给予柴胡水煎液后,SSa、SSc、SSb1、SSb2与肺、心的亲和力较强,尤其是肺组织,表明其更倾向于向肺组织分布;柴胡水煎液组与醇提物比较,向肺组织的分布趋势相同,对于其它组织,水煎液组倾向于心组织,醇提组倾向于肝组织,可能由两种提取物中共存成分不同导致;灌胃给予大鼠柴胡+白芍水煎液后,各成分在肾组织分布量明显增大,并且含量高于肺组织,表明与白芍配伍增加了柴胡皂苷肾组织分布,这一现象可能与白芍的收敛作用有关。结论:本研究通过UPLC-MS分析鉴定了柴胡中23种化学成分,结合代谢组学筛选出柴胡药代指标成分5种,并对其进行了定量分析。本研究中建立的UPLC-MS方法灵敏、快速、可靠,并成功的用于柴胡药代动力学及组织分布研究,获得了柴胡皂苷类成分的药动学参数,揭示了各成分在不同组织中分布特点。结果显示虽然在体外柴胡醇提物中成分种类和数目较多,但是水煎液进入体内后各成分更容易吸收,两种方式各有优势,在临床使用时应依据药理作用选择。