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目的：
成熟的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)细胞生理条件下处于静息状态，细胞与细胞之间规则排列，组成单层上皮组织夹在神经视网膜和脉络膜之间维护神经视网膜功能。其上皮的完整性依靠相邻细胞间、细胞与基底膜间三种类型细胞连接(紧密、锚定和缝隙连接)的相互作用来维持。三种连接中标志性的连接蛋白分别是zonaoccludens1(ZO-1)，E-cadherin(E-Ca)和connexin43(CX 43)。
增生性玻璃体视网膜病变(Proliferative vitreoretinopathy，PVR)是视网膜脱离手术失败的主要原因，且自始至终未找到肯定的临床治疗方法成为眼科研究领域的难题。PVR发病机制中一个重要机制是游离的视网膜色素上皮RPE细胞发生了向间充质细胞转换(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)。然而，RPE细胞发生EMT之前首先是细胞失去接触，即细胞间的连接蛋白发生破坏或表达异常，但是PVR微环境下，RPE细胞间连接蛋白的早期变化及其内在的关联和机制尚无深入研究。
本研究将调查PVR微环境下，在RPE细胞发生EMT前，三种连接蛋白E-Ca，CX43及ZO-1的联动变化；阐明RPE细胞EMT前失去正常接触的作用机制。
方法：
(1 )取用于角膜移植的捐献眼球，从中提取并培养人原代RPE细胞(phRPE)，用10ng/ml的TGF-β1分别处理phRPE细胞0h，1.5h，3h，6h，12h等不同时间梯度后，通过蛋白质印迹法检测TGF-β1作用的早期阶段细胞中E-Ca，CX43和ZO-1的表达变化。
(2)分别设计、合成针对E-Ca，CX43和ZO-1蛋白的特异性siRNA。将siRNA分别转染进phRPE细胞从而敲低E-Ca，CX43和ZO-1的表达，通过蛋白质印迹法和实时定量PCR检测敲低效率并观察其他两种蛋白的表达变化，以描绘这三种蛋白之间的调控网络。
(3)取C57BL/6小鼠的视网膜，应用透射电子显微镜(TEM)观察小鼠RPE中细胞间连接的超微结构。
(4)通过分离小鼠的视网膜色素上皮-Bruch’s膜-脉络膜复合体(RBCC)，脱色素后铺片进行免疫荧光染色，观察三种细胞间连接蛋白的表达和定位情况。
(5)构建E-Ca和Cx43的过表达质粒，在ARPE-19细胞中分别过表达E-Ca和CX43，随后用分别用E-Ca和Cx43的抗体进行免疫共沉淀，用WB检测共沉淀物中另两种蛋白的表达以明确其是否有直接互作关系。
(6)用siRNA在ARPE-19细胞中分别进行E-Ca，CX43和ZO-1的敲低，然后进行荧光黄染料转移实验，以检测ARPE-19细胞缝隙连接功能的改变。以同样的方法分别敲低phRPE细胞的三种蛋白后使用transwell进行FITC-葡聚糖细胞渗透性实验测定以观察上皮屏障功能改变。
结果：
(1)phRPE细胞在TGF-β1处理后E-Ca，CX43和ZO-1蛋白表达水平均在12h内逐渐下降，而在这三个蛋白中，E-Ca是第一个发生下调的蛋白。
(2)E-Ca，CX43和ZO-1这三种蛋白质其中任一种的敲低均会导致其他两种蛋白质的下调。
(3)透射电子显微镜发现，小鼠RPE细胞间三种连接结构：粘附连接(黏着带，桥粒)，缝隙连接和紧密连接彼此靠近。
(4)免疫荧光检测小鼠的RBCC显示，在RPE细胞中E-Ca，CX43和ZO-1存在共定位。
(5)免疫共沉淀发现，三种连接蛋白彼此之间存在直接互作结合关系。
(6)敲低E-Ca，CX43和ZO-1其中任意一种蛋白，均会对RPE细胞的缝隙连接功能和上皮屏障功能造成损伤。
结论：
研究证明，PVR微环境下(TGF-β1)RPE细胞发生EMT前，细胞间的三种连接蛋白E-Ca，CX43和ZO-1表达下调，E-Ca是最早发生下调的蛋白。E-Ca、CX43和ZO-1相互调控和结合，共同形成细胞间连接复合体，维持细胞间连接的结构。
成熟的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)细胞生理条件下处于静息状态，细胞与细胞之间规则排列，组成单层上皮组织夹在神经视网膜和脉络膜之间维护神经视网膜功能。其上皮的完整性依靠相邻细胞间、细胞与基底膜间三种类型细胞连接(紧密、锚定和缝隙连接)的相互作用来维持。三种连接中标志性的连接蛋白分别是zonaoccludens1(ZO-1)，E-cadherin(E-Ca)和connexin43(CX 43)。
增生性玻璃体视网膜病变(Proliferative vitreoretinopathy，PVR)是视网膜脱离手术失败的主要原因，且自始至终未找到肯定的临床治疗方法成为眼科研究领域的难题。PVR发病机制中一个重要机制是游离的视网膜色素上皮RPE细胞发生了向间充质细胞转换(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)。然而，RPE细胞发生EMT之前首先是细胞失去接触，即细胞间的连接蛋白发生破坏或表达异常，但是PVR微环境下，RPE细胞间连接蛋白的早期变化及其内在的关联和机制尚无深入研究。
本研究将调查PVR微环境下，在RPE细胞发生EMT前，三种连接蛋白E-Ca，CX43及ZO-1的联动变化；阐明RPE细胞EMT前失去正常接触的作用机制。
方法：
(1 )取用于角膜移植的捐献眼球，从中提取并培养人原代RPE细胞(phRPE)，用10ng/ml的TGF-β1分别处理phRPE细胞0h，1.5h，3h，6h，12h等不同时间梯度后，通过蛋白质印迹法检测TGF-β1作用的早期阶段细胞中E-Ca，CX43和ZO-1的表达变化。
(2)分别设计、合成针对E-Ca，CX43和ZO-1蛋白的特异性siRNA。将siRNA分别转染进phRPE细胞从而敲低E-Ca，CX43和ZO-1的表达，通过蛋白质印迹法和实时定量PCR检测敲低效率并观察其他两种蛋白的表达变化，以描绘这三种蛋白之间的调控网络。
(3)取C57BL/6小鼠的视网膜，应用透射电子显微镜(TEM)观察小鼠RPE中细胞间连接的超微结构。
(4)通过分离小鼠的视网膜色素上皮-Bruch’s膜-脉络膜复合体(RBCC)，脱色素后铺片进行免疫荧光染色，观察三种细胞间连接蛋白的表达和定位情况。
(5)构建E-Ca和Cx43的过表达质粒，在ARPE-19细胞中分别过表达E-Ca和CX43，随后用分别用E-Ca和Cx43的抗体进行免疫共沉淀，用WB检测共沉淀物中另两种蛋白的表达以明确其是否有直接互作关系。
(6)用siRNA在ARPE-19细胞中分别进行E-Ca，CX43和ZO-1的敲低，然后进行荧光黄染料转移实验，以检测ARPE-19细胞缝隙连接功能的改变。以同样的方法分别敲低phRPE细胞的三种蛋白后使用transwell进行FITC-葡聚糖细胞渗透性实验测定以观察上皮屏障功能改变。
结果：
(1)phRPE细胞在TGF-β1处理后E-Ca，CX43和ZO-1蛋白表达水平均在12h内逐渐下降，而在这三个蛋白中，E-Ca是第一个发生下调的蛋白。
(2)E-Ca，CX43和ZO-1这三种蛋白质其中任一种的敲低均会导致其他两种蛋白质的下调。
(3)透射电子显微镜发现，小鼠RPE细胞间三种连接结构：粘附连接(黏着带，桥粒)，缝隙连接和紧密连接彼此靠近。
(4)免疫荧光检测小鼠的RBCC显示，在RPE细胞中E-Ca，CX43和ZO-1存在共定位。
(5)免疫共沉淀发现，三种连接蛋白彼此之间存在直接互作结合关系。
(6)敲低E-Ca，CX43和ZO-1其中任意一种蛋白，均会对RPE细胞的缝隙连接功能和上皮屏障功能造成损伤。
结论：
研究证明，PVR微环境下(TGF-β1)RPE细胞发生EMT前，细胞间的三种连接蛋白E-Ca，CX43和ZO-1表达下调，E-Ca是最早发生下调的蛋白。E-Ca、CX43和ZO-1相互调控和结合，共同形成细胞间连接复合体，维持细胞间连接的结构。