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T7 RNA聚合酶/T7启动子表达系统(简称T7系统)是基于T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase,T7 RNAP)及其强启动子之间识别的特异性和高效性而建立起来的基因表达系统,能够对外源基因进行高效的转录和翻译。利用T7系统已经在大肠杆菌中成功表达了多种外源基因。目前,人们已经尝试应用该高效表达系统在其他宿主细胞中进行外源基因的表达。蓝藻,又称蓝细菌,是一种光合自养原核生物。培养条件简单、成本低廉,且不易污染环境,由于其不形成包涵体、不需做复性、变性处理,目前已有很多有用的外源基因被导入到蓝藻中并成功表达,所以它是一种十分理想的遗传体系。蓝藻作为一种新的遗传转化体系备受关注。但是,蓝藻中外源基因表达效率低是蓝藻基因工程发展的瓶颈,制约了蓝藻基因工程制药的产业化。实验目的:构建一种基于T7RNA聚合酶的外源基因表达体系来高效表达发光酶基因lux AB的转基因鱼腥藻。利用该系统表达外源基因,需要在宿主细胞中存在2个必需成分:T7 RNA聚合酶和T7启动子。本课题组前期构建了含有T7 RNA聚合酶基因的定点整合载体,因此本课题研究目的:1.利用电击转化的方法将含有T7 RNA聚合酶的定点整合载体整合到鱼腥藻基因组中;2.利用卡那霉素抗性筛选转基因藻;3.构建含有T7启动子和lux AB基因的穿梭表达载体并利用三亲接合转移的方法转入到上述转基因藻中。实验方法:1.外源基因转入蓝藻的方法:电击转化法和三亲接合转移法2.载体构建方法利用PCR法获得含有T7启动子的小片段,由于T7启动子序列小,采用设计引物加上相应酶切位点和启动子序列的方法进行PCR来获得含有T7启动子和相应酶切位点的片段。利用相应的限制性内切酶对载体进行酶切,回收目的片段,然后利用DNA连接酶对相应的载体片段进行连接。3.转基因藻的筛选和评价抗性筛选:将培养基中加入相应的抗性进行抗性筛选,浓度由低到高直到转基因藻生长稳定。PCR检测:将转基因藻破碎或提取转基因藻基因组,加入目的片段的引物和相应的酶和离子,在PCR仪进行扩增,将扩增产物进行凝胶电泳检测。实验结果:1.定点整合载体通过HindⅢ限制性内切酶酶切,获得了大小为9800 bp左右的线性片段,电击转化鱼腥藻,经卡那霉素抗性筛选获得具有抗性的转基因藻;2.为了确定定点整合载体是否被整合到鱼腥藻基因组中,将上述具有抗性的转基因鱼腥藻通过多次不同对引物进行P C R验证,结论在900 bp大小即卡那霉素抗性基因处有条带。3.PT7小片段TA克隆到克隆载体通过测序结果与目的序列比对结果显示一致,穿梭表达载体构建后通过EcoRI、XhoI双酶切鉴定后显示酶切大片段约为11000 bp左右,小片段为600 bp左右,大小正确,证明穿梭表达载体构建成功。