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研究背景多发性硬化（multiple sclerosis,MS）是一种以中枢神经系统（central nervous system,CNS）受累为主的慢性疾病。MS可累及一个或多个CNS部位,临床可表现视力障碍、肢体无力、感觉异常、共济失调等一个或多个神经功能障碍的组合。MS好发于青壮年,是青壮年非创伤性残疾的常见原因之一,对个人、家庭以及社会影响巨大。目前MS无特效的治疗方法,特别是进展型MS。临床上急性期仍以大剂量免疫球蛋白及甲泼尼龙（methylprednisolone,MP）、疾病缓解期的修饰治疗（disease-modifying therapy,DMT）为主。MS是一种慢性疾病,大多具有复发-缓解的病程,临床上需要长期多次大剂量MP治疗,往往有引起高血压、骨质疏松、血糖增高等副作用的一系列风险。MS女性患者患病率高、临床病程多表现为复发-缓解,其在性别上的偏倚引起了人们对雌激素广泛关注,雌激素已被证明在实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）中具有神经保护作用。然而,长期雌激素替代治疗具有增加血栓栓塞事件发生及诱发生殖系统肿瘤等风险。前期研究表明,淫羊藿主要活性成份淫羊藿苷（icariin,ICA）主要通过上调脑组织雌激素受体β（estrogen receptorβ,ERβ）蛋白水平的表达介导EAE神经保护作用,且不增加子宫及血浆中肿瘤发病相关血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达,具有良好的应用前景。MS归属于中医学“痿证”的范畴。其基本病机为内伤虚损,其病位责之于脾肾。淫羊藿具有温补肾阳、黄芪具有健脾益气作用,两者均具有拟雌激素效应,将淫羊藿及黄芪配置成藿芪调元汤可能对神经免疫性疾病具有保护作用。然而,具有植物雌激素活性的淫羊藿与黄芪配制的某种浓度藿芪调元汤是否能较好改善EAE临床症状,其免疫调节及抗炎等作用以及其神经保护作用的机制尚不明确。研究目的本实验采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55,MOG35-55)诱导雌性C57BL/6小鼠构建EAE小鼠模型。构建成功的EAE小鼠给予不同浓度藿芪调元汤治疗。比较不同浓度藿芪调元汤治疗后,观察EAE小鼠行为学变化、细胞因子水平、脊髓病理及凋亡水平的变化,研究藿芪调元汤对EAE的免疫调节及抗炎作用,并探讨有效的治疗剂量。分析霍芪调元汤在不同剂量情况下对外周血中内源性雌激素水平的影响,以期验证霍芪调元汤是否通过调节内源性雌激素水平发挥神经保护作用。研究方法第一部分1、EAE模型的构建:采用主动免疫法诱导EAE。选择周龄介于6-7周、无特定病原体（specific pathogen free,SPF）级雌性C57BL/6小鼠56只,其中50只用于构建EAE模型,其余6只设置为正常对照组。PBS将多肽MOG35-55稀释成6mg/ml,并按1:1等体积加入完全弗氏佐剂（complete freund’s adjuvant,CFA）（结核分枝杆菌H37Ra终浓度为5mg/ml）,经充分乳化为油包水状态的抗原乳剂,按每只小鼠0.2ml接种于已用戊巴比妥钠麻醉小鼠脊柱两侧的皮下,分四点皮下注射。在第7天,再次使用等剂量的MOG35-55/CFA抗原乳剂进行第2次免疫。在初次免疫后第0天和第48小时,以每只小鼠0.1ml的浓度为5μg/ml的百日咳毒素（pertussis toxin,PTX）进行腹腔注射。正常对照组不作上述处理。2、EAE模型的鉴定:接种免疫后所有小鼠每天同一时间段进行称重和神经功能评分。采用Weaver’s15分法给小鼠进行每日评分。在小鼠发病高峰期（发病后3天内神经功能评分不变）按神经功能损害评分相当的原则抽取6只神经功能评分大于3分的EAE模型小鼠作为模型对照组及6只正常小鼠作为正常对照组。吹出法取脊髓腰膨大用于苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色观察脊髓炎性细胞浸润情况,劳克坚牢蓝（luxol fast blue,LFB）染色观察脊髓髓鞘损伤程度,甘氨酸银浸镀染色观察脊髓轴突损伤水平以及甲苯胺蓝染色观察神经元变性情况。从行为学及病理学层面评估EAE模型是否构建成功。第二部分1、小鼠的分组及给药选取神经功能评分大于3分的且神经功能评分3天内未改变的EAE小鼠,随机分成4组,每组6只。分别为大剂量藿芪调元汤组:予以霍芪调元汤57g/kg.d灌胃;中剂量藿芪调元汤组:予藿芪调元汤稀释后按38g/kg.d灌胃;小剂量藿芪调元汤组:予藿芪调元汤稀释后按19g/kg.d灌胃;模型对照组:予以等容量0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃;另外再取6只正常小鼠作为正常对照组,予以等容量0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃。每天同一时间段给药1次,连续给药5天。2、E2、细胞因子水平检测采用摘除小鼠眼球法采血。血液采集后的在室温下静置20 min,然后用台式高速冷冻离心机在4℃下12000 r/min离心20 min后取上清液。取血清采用放射免疫法检测E2水平、酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测细胞因子转化生长因子（transforming growth factor-β1,TGF-β1）、IL-17的含量。3、脊髓炎症浸润及凋亡水平检测脊髓腰膨大常规进行石蜡包埋切片,HE染色、DNA断裂原位末端缺口标记法（terminal dexynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling,TUNEL）进行炎症细胞浸润情况以及凋亡检测。研究结果第一部分1、小鼠行为学变化:接种后第13天开始陆续起病,EAE模型小鼠表现为神情疲惫,活动减少,体重开始减轻。逐渐出现不同程度神经功能缺失症状,其中首发症状以尾部远端无力为主,尾部无力可恶化为肢体无力或不同程度的瘫痪,其中以后肢瘫痪为主,个别伴有小脑功能障碍,表现为平衡失调,严重的伴有自主神经功能障碍,表现为大小便失禁现象。绝大部分EAE小鼠呈慢性病程。正常对照组小鼠未观察到神经功能缺损症状,体重逐渐增加。2、小鼠病理学改变:脊髓腰膨大HE染色结果显示,EAE小鼠脊髓组织中有大量炎症细胞浸润,炎症细胞较多见于脊髓边缘白质局灶性浸润。神经功能缺损严重的EAE小鼠炎症细胞部分侵入脊髓实质区域,不伴明显的血管袖套形成。LFB髓鞘染色结果显示脊髓组织白质区大小不等的斑片状髓鞘脱失,白质排列疏松,严重的病变呈空泡样改变。甘氨酸银浸镀染色结果显示神经原纤维密度均匀减少,轴索弥漫性肿胀变形。甲苯胺蓝染色结果显示脊髓灰质区大多数神经元肿胀,大多数尼氏小体轮廓尚清晰,着色稍变浅,胞浆中嗜碱性颗粒减少,病变严重的尼氏小体溶解融合,残留部分嗜碱性颗粒。在正常对照组中,除HE染色可见少量炎性细胞散在分布,未观察到明显的病理改变。第二部分1、小鼠体重变化:藿芪调元汤治疗组治疗前体重均低于正常对照组（P<0.05）。藿芪调元汤治疗组治疗中体重均略有上升,但无统计学意义（P>0.05）。与治疗前比较,小剂量组和中剂量组小鼠体重均显著增加（P<0.01）,大剂量组治疗后体重轻微升高,但与治疗前比较未见明显差异（P>0.05）。2、小鼠神经功能评分变化:不同剂量组治疗前神经功能评分无明显差异（P>0.05）,模型对照组治疗前后神经功能评分无差异（P>0.05）,小剂量组、中剂量组和大剂量组治疗前后比较,神经功能评分均有轻度的下降（P<0.05）。3、小鼠血清E2水平变化:大剂量组血清E2水平明显高于正常对照组和模型对照组（P<0.01）。与正常对照组比较,小剂量组、中剂量组血清E2水平均有升高（P<0.05）。与模型对照组比较,小剂量组血清E2水平有升高（P<0.05）,中剂量组较模型对照组升高,但无统计学意义（P>0.05）。4、小鼠血清TGF-β1水平变化:与正常对照组比较,模型对照组血清TGF-β1水平下降,差异有统计学意义（P<0.05）。小剂量组和中剂量组血清TGF-β1水平较模型对照组明显升高（P<0.01）,大剂量组血清TGF-β1水平较模型对照组有升高,但无统计学意义。小剂量组与大剂量组比较,小剂量组有升高,差异有统计学意义（P<0.05）。5、小鼠血清IL-17水平变化:与正常对照组相比较,模型对照组、小剂量组和中剂量组血清IL-17水平均明显升高（P<0.01）,大剂量组略有升高（P<0.05）。小剂量组、大剂量组与模型对照组相比较,血清IL-17水平虽有降低,但差异无统计学意义（P>0.05）。6、小鼠脊髓炎性细胞浸润水平变化:正常对照组HE评分明显低于模型对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。小剂量组、中剂量组、大剂量组评分均低于模型对照组,但差异均无统计学意义（P>0.05）。7、小鼠脊髓组织凋亡水平变化:与模型对照组比较,小剂量组、中剂量组、大剂量组凋亡细胞数均减少（P<0.01）。与模型对照组比较,小剂量组、中剂量组细胞凋亡率下降,差异有统计学意义（P<0.05）,大剂量组凋亡率虽有下降,但差异无统计学意义（P>0.05）。研究结论1、藿芪调元汤通过上调血清抗炎因子TGF-β1的表达,减少脊髓组织凋亡,从而改善EAE小鼠神经功能损害,对EAE鼠发挥神经保护作用,其作用以小剂量和中剂量的藿芪调元汤治疗效果最为显著。2、藿芪调元汤增加小鼠内源性雌激素水平,具有拟雌激素样作用,不呈剂量依赖性。