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试验采用甜玉米自交系1132为受体材料,pCAMBIA-1300单子叶植物高效表达载体为基本载体,经过载体构建,转基因条件优化,遗传转化、转基因检测等试验过程,成功构建pCAMBIA-1300-GE2N载体,获得猪瘟保护性抗原基因E2的甜玉米转基因植株。
1.试验利用中间载体pUC18、pCR2.1、pBlueseriptSKⅡ、pMD-18T、pGFP-2、pUBCG等,将序列终止子nos、抗除草剂基因bar、玉米胚乳特异启动子Globulin、猪瘟表面抗原基因E2插入植物载体pCAMBIA-1300预定位置,成功构建pCAMBIA-1300-GE2N,用冻融法将该质粒转入农杆菌LBA4404中。利用农杆菌介导法将猪瘟保护性抗原基因导入甜玉米自交系,成功获得32株温室存活的转基因植株。经PCR检测,发现有6株具有E2特异条带,推断外源基因E2成功转入其基因组中。经过高浓度筛选标记产物(120 mg/L PPT)筛选鉴定,有4株表现PPT抗性,说明该4个株转基因植株有标记基因的表达。
2.分别设置继代天数、PPT浓度、预再生时间各因素的不同梯度,进行转基因条件的优化试验,发现继代天数增加,PPT浓度增高、预再生时间延长均使抗性愈伤组织的再生率低降低。继代天数在30天之内、PPT浓度为0 mg/L、预再生10天条件之下再生率都相对较高。
3.将pCAMBIA-1300-GE2N中猪瘟表面抗原基因E2酶切回收,成功插入原核表达载体pET-30C,成功构建pET-30C-E2。经过酶切鉴定后,将质粒转入工程菌BL21,用IPTG诱导,将表达产物SDS-PAGE全蛋白电泳,44.3KD位置成功表达。