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产油微生物能够在细胞内积累大量脂肪酸并以甘油三酯的形式储存,是传统动植物油脂的重要替代资源。某些微生物积累的油脂还富含高价值的多不饱和脂肪酸,具有重要的应用价值和商业价值。在产油微生物中,不同物种的微生物油脂产量相差巨大,其油脂积累量从细胞干重的20%到80%以上不等。由于不同物种间生理生化特征差异较大,导致不同微生物之间脂质积累差异的机制难于解析,而对同一物种产脂差异显著的不同菌株的研究能够很好地解决这一问题。本文通过基因组学、蛋白质组学以及关键酶的活性分析系统研究了卷枝毛霉高产脂菌株WJ11和低产脂菌株CBS 277.49在脂质代谢调控上的差异;结合转录分析找出了一些关键调控基因;通过基因工程过表达这些关键基因,有效提高了脂肪酸的积累;还研究了氨基酸氮源对卷枝毛霉γ-亚麻酸(GLA)产量的影响。论文的主要研究内容和实验结果如下:通过对卷枝毛霉WJ11和CBS 277.49生长和产脂的分析,发现WJ11脂肪酸含量高达36%,而CBS 277.49则不超过15%。WJ11全基因组的测序结果显示其基因组大小为35.4 Mb,包含827个scaffold,由2530个contig组成,GC含量为39.7%,有10973个预测的基因和177个t RNA基因。通过比较WJ11(本实验室测序)和CBS 277.49(美国联合基因研究所测序)的基因组发现,两株菌的基因组特征总体相似度较高,MAUVE分析显示两株菌的基因组序列拥有很多的同源区域,MUMmer分析也表明两株菌的基因组整体共线性良好。根据基因组信息,构建了WJ11和CBS 277.49中心碳代谢和脂代谢网络,包括葡萄糖的代谢,脂肪酸的合成,甘油三酯、磷脂、类固醇和类胡萝卜素的合成以及脂肪的β氧化。通过比较两株菌中编码这些代谢途径中相关酶的基因个数,发现基因个数的差异可能对两株菌的脂质积累产生影响。另外,通过Ortho MCL聚类分析找出了WJ11和CBS 277.49之间的特异基因,这些特异基因可能与两株菌的细胞生长和脂肪积累差异相关。利用蛋白质组学分析了高产脂菌株WJ11在脂质积累期(氮缺乏)和生长平衡期全蛋白的表达差异情况,结果发现氮缺乏促进了氮的同化,减缓了氨基酸的代谢;上调了糖酵解相关蛋白的表达并下调了三羧酸循环相关蛋白的表达,使更多的碳流向脂肪酸合成;氮缺乏提高了磷酸戊糖途径相关蛋白的表达,为脂肪酸合成提供更多的还原力NADPH;在氮缺乏时,蛋白质和核酸的代谢受到抑制,细胞主要进行脂质合成和积累;氮缺乏还上调了一些与能量代谢、信号传导、分子伴侣和氧化还原相关蛋白的表达,以应对氮限制这种环境压力。另一方面,通过比较高产脂菌株WJ11和低产脂菌株CBS277.49在脂质快速积累期全蛋白的表达差异,发现WJ11中与支链氨基酸代谢相关蛋白的表达显著上调,这可能为脂肪酸合成提供更多的底物乙酰辅酶A;与CBS 277.49相比,WJ11中糖酵解相关蛋白的表达量更高,而三羧酸循环相关蛋白的表达量则较低,这表明WJ11中碳更多流向脂肪酸的合成,而非参与三羧酸循环;WJ11中磷酸戊糖途径相关蛋白的表达量也较CBS 277.49要高,这表明WJ11中会产生更多的还原力NADPH。通过对卷枝毛霉WJ11和CBS 277.49脂质合成关键酶的活力测定发现,与CBS277.49相比,WJ11中果糖磷酸激酶(PFK)的酶活较低,而磷酸戊糖途径中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)的酶活较高,这将导致更多的碳流向磷酸戊糖途径,从而为脂肪酸合成提供更多的还原力NADPH;对于脂质合成过程中还原力的重要提供者苹果酸酶(ME),其在WJ11脂质积累初期的酶活也略微高出CBS 277.49;WJ11中调控三羧酸循环的异柠檬酸脱氢酶(ICDH)的酶活显著低于CBS 277.49,这表明WJ11中三羧酸循环更为缓慢,将会有更多的柠檬酸转运到线粒体外;同时WJ11中ATP:柠檬酸裂解酶(ACL)的酶活相比较CBS 277.49又有所提高,这将增加脂肪酸合成的前体乙酰辅酶A的供应;WJ11中脂肪酸合酶(FAS)的活力也明显高于CBS 277.49。这些酶活差异较为清晰地解析了WJ11高产脂质的调控机制。针对脂质合成中的关键酶以及蛋白质组分析得到的重要差异蛋白,利用RT-q PCR研究它们基因的转录水平,结果显示转录分析数据能够与酶活及蛋白质组数据较好的对应;并发现与生长平衡期相比,WJ11中的g6pdh1和g6pdh2基因的表达在脂质积累期提高幅度较大,推测这两个基因可能与脂质积累密切相关;同时还发现脂质积累期WJ11中与支链氨基酸代谢相关基因(如leu B)的转录水平下调幅度要显著小于CBS 277.49,这些基因也可能通过某种机制参与卷枝毛霉脂质合成的调控。基因组、蛋白质组、酶活以及转录分析的数据显示,WJ11中g6pdh1、g6pdh2及leu B基因可能对脂质积累有重要的调控作用。通过在卷枝毛霉CBS 277.49缺陷型菌株中过表达WJ11中的g6pdh1、g6pdh2及leu B基因,发现这些基因对卷枝毛霉的生长没有明显影响,但均显著提高了脂肪酸的积累:其中过表达g6pdh1的重组菌株脂肪酸含量提高了23~28%,过表达g6pdh2的重组菌株脂肪酸含量提高了41~47%,这表明g6pdh1和g6pdh2均能够调控卷枝毛霉的脂质积累,且g6pdh2的效果更为显著;另外,leu B基因的过表达使重组菌株脂肪酸含量提高了67~73%,表明leu B基因在脂肪酸积累过程中起到重要的调控作用。针对氨基酸对于脂肪酸积累可能的调控作用,分别以二十种标准氨基酸为氮源培养卷枝毛霉,分析其细胞生长、脂质积累及GLA产量。首先比较本实验室三株卷枝毛霉(WJ11、CBS 108.16和CBS 277.49)GLA的积累能力,发现WJ11总脂肪酸含量最高,但由于脂肪酸组分中GLA比例较低,使GLA产量显著小于CBS 108.16,因此选取CBS108.16作为研究菌株。利用不同氨基酸为氮源培养卷枝毛霉CBS 108.16,发现其菌体生长、脂肪酸积累以及GLA产量会有显著差别,其中,酪氨酸为最适合生长和脂质积累的氮源,且GLA产量也最高(0.81 g/L)。通过对脂肪酸合成相关酶活力的测定,发现酪氨酸显著提高了G6PDH和6PGDH的活力,为脂肪酸合成提供更多的还原力;酪氨酸也提高了ACL的活力,为脂肪酸合成提供更多的乙酰辅酶A,同时,ICDH活力的下调也可能减缓了三羧酸循环,促进脂肪酸的合成。这与蛋白质组学及WJ11与CBS 277.49脂质合成相关酶的活力分析结果相一致。