柳枝稷脱分化基因PvCAL1的分离与功能研究

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柳枝稷(Panicum virgatum L.)是重要的C4禾本科能源植物之一,可以产出生物乙醇替代化石燃料,具备很高的生物能源潜力。柳枝稷的脱分化能力差,并受基因型限制,严重的制约了柳枝稷遗传转化研究的进程,阻碍了柳枝稷的开发与利用。因此建立高效的遗传转化体系,培育柳枝稷优良品种有利于扩展柳枝稷的生物能源价值,提高其经济效益。本研究前期提取柳枝稷总RNA通过FOX hunting system(Full-length cDNA Over-expression gene hunting system)技术获得了柳枝稷FOX拟南芥文库,对FOX拟南芥文库进行柳枝稷愈伤诱导相关基因的筛选及其功能研究。研究结果如下:1通过表型筛选得到了柳枝稷脱分化基因PvCallus1(PvCAL1),扩增PvCAL1构建诱导型载体转化拟南芥,筛选并分离到2个纯合株系PvCAL1-IOE1和PvCAL1-IOE3。2 分析 PvCAL1 结构域:PvCAL1 包含 Alanine-rich region profile、WRKY domain profile和WRKYDNA-binding domain等结构域,与WRKY同源,亚细胞定位分析发现PvCAL1定位于细胞核,表明PvCAL1是一个转录因子。烟草光能转换效率实验表明这三个结构域均能导致烟草叶片枯萎,光系统Ⅱ的最大光合效率降低。3以PvCAL1-IOE1为实验材料进行转录组分析:筛选PvCAL1表达8 h和16 h下的显著差异表达基因,结果显示:8hvs CK差异表达基因数量远远大于16hvs CK,分别为8685个和4586个,上调基因分别为3959个和2306个,下调基因分别为4726个和2280个;16 hvs CK差异基因表达模式与CK更为相似。差异基因主要为:(1)3-ketoacyl-CoA合成酶家族蛋白(2)转录因子(3)生长素响应因子(4)锌指蛋白(5)休眠/生长素相关家族蛋白(6)响应胁迫相关基因。4对差异基因进行GO富集分析:8 hvs CK生物过程主要包含代谢过程、生物调节和刺激响应等,细胞组分方面主要包含细胞、细胞的一部分和细胞器等,分子功能包含结构分子活性、分子功能和核糖体的结构组成;16hvs CK在细胞组分上与8hvs CK相似,生物过程重点集中在响应刺激条目,分子功能特异性富集在DNA结合转录因子活性上。KEGG通路分析表明差异基因主要在代谢途径、次级代谢的生物合成和植物激素信号转导;PvCAL1表达下 LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN(LBD)基因家族表达变化显著,表明LBDs可能参与PvCAL1调控下的愈伤的形成。选取LBD16、LBD17、LBD18和LBD29进行qRT-PCR验证,发现PvCAL1能够激活其表达,结果与高通量测序结果一致。ChIP实验进一步证明PvCAL1能够结合到LBDs基因的启动子w-box区域,从而激活其基因表达。5利用酵母双杂交技术筛选PvCAL1的互作蛋白,获得了 36个阳性克隆,选取蛋白进行酵母双杂交验证,结果显示PvCAL1与AT3G12050,AT3G26900和AT5G47430蛋白互作;利用IP-MS技术对PvCAL1互作蛋白进行筛选和质谱分析,共鉴定到234个蛋白,对其进行基因注释和蛋白功能分析,初步获得30个互作蛋白。
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