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实验目的:硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein,Txnip)发现于1,25-二羟维生素D3处理的HL-60细胞,因此早前命名为维生素D3上调蛋白1(vitamin D3 upregulated protein 1,VDUP1)。Txnip可以与硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)结合,从而抑制Trx的抗氧化功能,导致活性氧的累积与细胞压力。经葡萄糖处理后,Txnip在人胰岛中表达高度上调,具有平衡代谢和调节细胞生长、分化的功能。但Txnip在雄性睾丸中的表达定位与功能研究尚未见报道,是否在糖尿病导致的雄性生殖功能受损中扮演某种角色值得研究。基于此,本研究拟通过制备糖尿病小鼠模型,观察Txnip基因敲除是否具有拮抗睾丸损伤的效应及其可能的机制,为临床上防治糖尿病生殖损伤提供实验依据。实验方法:1.免疫组化、免疫荧光、PCR和western blot方法检测Txnip在小鼠睾丸中表达情况。2.繁殖Txnip基因敲除小鼠(TALEN技术制备)与野生型小鼠,用于糖尿病模型制备。首次注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)前禁食12 h,按55 mg/kg剂量腹腔内注射STZ,连续5d。实验分组:野生型小鼠组(WT)、Txnip基因敲除组(KO)、WT+STZ组和KO+STZ组,每组6只小鼠。6 d后用血糖测定仪(ACCU CHEK,罗氏)检测血糖。野生型小鼠血糖大于16.7 mmol/L视为造模成功。常规饲养60 d后处死小鼠,取血液与睾丸标本,用于进一步实验。3.免疫组化、western blot检测Txnip基因敲除对小鼠睾丸Txnip表达的影响。睾丸标本制成石蜡切片,通过HE染色和TUNEL实验观察小鼠睾丸的形态学变化及检测精细胞的凋亡情况。并且测定小鼠睾丸组织中MDA含量与SOD活性。实验结果:1.免疫组化、免疫荧光、PCR及western blot实验结果显示Txnip表达于小鼠睾丸组织中支持细胞、间质细胞及精细胞区域;体外实验显示Txnip表达于睾丸TM4支持细胞及TM3间质细胞的胞质。2.免疫组化与western blot实验结果表明在Txnip敲除小鼠睾丸中未检测到Txnip表达。STZ诱导野生型小鼠血糖明显增加,Txnip基因敲除明显抑制血糖的增加。3.睾丸组织学结果显示Txnip基因敲除抑制睾丸形态学损伤与生精细胞凋亡,下调凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2表达比值。此外,Txnip敲除明显下调糖尿病小鼠模型睾丸MDA水平,上调SOD活性。实验结论:Txnip表达在小鼠睾丸组织中支持细胞、间质细胞及精细胞区域,体外实验显示Txnip表达于TM4支持细胞及TM3间质细胞的胞质。STZ可以诱导血糖上升,但敲除Txnip明显抑制血糖的增加。通过分析睾丸形态学,发现Txnip基因敲除抑制睾丸形态学损伤与生精细胞凋亡,下调凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2表达比值。此外,Txnip敲除明显下调糖尿病小鼠模型睾丸MDA水平,上调SOD活性。本研究揭示Txnip基因敲除可以拮抗高血糖引起的睾丸生精细胞凋亡与氧化压力增加,从而有效发挥抗生殖损伤的作用。进一步研究其机理对防治糖尿病导致的雄性生殖功能异常具有重要意义。