【摘 要】
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为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP5和M蛋白对外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）激活功能。以PRRSV PC疫苗株RNA为模板,应用RT-PCR扩增GP5和M基因片段,克隆至原核表达载体p ET-32a（+）,构建重组质粒p ET-32a-GP5和p ET-32a-M,经过酶切和测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）
【基金项目】
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金宇保灵生物药品有限公司研发基金；
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为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP5和M蛋白对外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）激活功能。以PRRSV PC疫苗株RNA为模板,应用RT-PCR扩增GP5和M基因片段,克隆至原核表达载体p ET-32a（+）,构建重组质粒p ET-32a-GP5和p ET-32a-M,经过酶切和测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,加入IPTG低温诱导表达。使用亲和层析纯化表达PRRSV-GP5和PRRSV-M蛋白。结果显示GP5和M重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式表达,分子质量均约为30 KDa;将纯化蛋白分别免疫大耳白兔,按常规方法制备抗血清并利用酶联免疫吸附试验（ELISA）,测其抗血清效价。结果表明,纯化后的蛋白可以与PRRSV阳性血清特异性结合;制备的兔抗血清效价高达1:64000,无菌采集未被猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的猪外周血,分离出单个核细胞,并分别加终浓度为10μg/m L的GP5和M重组蛋白进行体外培养,并用免疫荧光抗体技术（IFA）观察两种重组蛋白与PBMC的结合情况。IFA结果显示,PBMC出现红色荧光。表明表达的两种蛋白均与PBMC结合。进一步采用不同浓度的两种重组蛋白体外刺激猪PBMC,利用ELISA方法检测淋巴细胞中IL-10、IFN-γ、TGF-β1及TNF-α的分泌,同时采用CCK-8细胞增殖检测试剂盒测定两种重组蛋白对PBMC增殖影响情况,以及不同浓度的两种重组蛋白刺激PBMC分泌NO的情况,结果显示,不同浓度的两种重组蛋白显著促进了PBMC细胞因子IL-10、IFN-γ和TNF-α的分泌（p<0.05）:并且能够刺激PBMC引起PBMC增殖和增加NO分泌（p<0.05）。
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