一、研究背景肾细胞癌(renal cell carcinoma)是肾恶性肿瘤中最常见肿瘤类型,占泌尿生殖系统恶性肿瘤的第三位。随着腹部影像检查的普及,越来越多的局限性早期肾癌被发现,但仍有一部分肾癌发现时已处于晚期阶段。目前,肾癌根治术是局限性早期肾癌治疗的金标准。然而术后仍有部分患者出现肿瘤的复发或远处转移,其潜在的机制仍未知。尽管近年来的分子生物和靶向VEGFR治疗的发展给晚期进展性肾细胞癌带来了希望,但是大约有50%的患者对靶向治疗不敏感,或者有大部分患者在服药后1年左右对靶向药物产生耐受。因此探索肾细胞癌治疗的新靶点,增加对肾细胞癌发生发展的潜在分子机制的认识,进而为临床肾细胞癌的早期诊断及预后提供依据,已成为泌尿外科的重要研究热点。EIF3D是翻译起始因子的主要成员。作为一个相对较新的分子,目前研究报道较少,且大多仅限于肿瘤表型的研究。研究表明,EIF3D与恶性肿瘤细胞的抗凋亡相关,敲除EIF3D基因能够抑制间皮瘤细胞的恶性增殖。通过丁型肝炎病毒感染HEK-293细胞后检测蛋白质组的变化,发现EIF3D表达上调,指出EIF3D与肝癌的发生有关。也有报道表明EIF3D和肠癌、黑色素瘤以及胶质瘤的恶性增殖有关,但尚未对其下游机制进行深入探讨。在肾细胞癌中,EIF3D的功能作用尚未阐明。为了进一步阐释EIF3D在肾细胞癌恶性增殖的作用机制,我们采用基因数据库、配对新鲜肾细胞癌组织、肾细胞癌组织微阵列检测EIF3D在肾细胞癌组织中的mRNA和蛋白表达水平。随后应用慢病毒介导敲减模型在肾细胞癌细胞株中沉默EIF3D后,进行一系列肿瘤细胞生物学特性及其下游机制的研究。二、目的探索EIF3D在肾细胞癌组织中表达水平和对肾细胞癌细胞的生物学特性影响及其分子机制。三、方法(一)在肾细胞癌新鲜组织、肾细胞癌组织切片及基因数据库中检测EIF3D的mRNA和蛋白的表达水平。于2015年1月至2015年6月在上海长征医院泌尿外科收集20对新鲜组织肾细胞癌组织标本。所有标本通过两种途径保存:1、制成免疫组化检测玻片;2、新鲜组织液氮保存。102例肾细胞癌患者组织微阵列芯片由上海市长海医院泌尿外科赠送。以上组织标本通过免疫组化和蛋白印迹法(Western Blot)检测EIF3D的蛋白表达水平,并分析与临床指标的相关性。应用ONCOMINE基因数据库分析EIF3D在肾细胞癌的mRNA表达水平及与临床指标的相关性。(二)、构建沉默EIF3D慢病毒载体和刷选稳定沉默EIF3D的肾细胞癌细胞株设计靶向EIF3D的sh RNA序列,插入含绿色荧光报告基因(GFP)的质粒中,构建稳定沉默EIF3D的慢病毒载体。应用蛋白免疫印迹方法检测6种肾细胞癌细胞株中EIF3D的表达水平,挑选2株高表达EIF3D细胞株作为稳定沉默EIF3D的候选细胞株。将已重组的沉默EIF3D的慢病毒感染这2株肾细胞癌细胞,通过绿色荧光表达情况判断感染效率,利用Real-time PCR和Western Blot检测EIF3D的敲减效率。(三)、检测稳定沉默EIF3D肾细胞癌细胞株的细胞增殖和细胞克隆的肿瘤生物学特征的改变情况在稳定沉默EIF3D的肾细胞癌细胞株的基础上,采用MTT实验和克隆形成实验,检测稳定沉默EIF3D细胞株的细胞增殖情况和单细胞克隆形成情况。(四)、探索沉默EIF3D后影响肾细胞癌细胞恶性增殖的分子机制利用流式细胞分选技术检测定沉默EIF3D的肾细胞癌细胞株的细胞周期分布情况,进行统计分析。再通过Western Blot检测和ONCOMINE基因数据库分析影响细胞周期分布的调控分子,阐释其分子机制。四、结果(一)在肾细胞癌组织中EIF3D的蛋白表达水平上调通过蛋白免疫印迹方法检测新鲜肾细胞癌与配对癌旁组织,发现肾细胞癌中EIF3D蛋白表达水平显著上调(P=0.005)。免疫组化染色发现,肾细胞癌组织标本染色较癌旁组织明显加深,且阳性细胞数目增多,存在显著差异(P<0.001)。(二)EIF3D的表达水平与肾细胞癌患者的临床特征成正相关肾细胞癌组织微阵列芯片检测发现EIF3D表达水平与肿瘤大小(P=0.004)和TNM分期(P=0.03)呈显著地正相关,且随着EIF3D染色密度加深,TNM分期不断增加。(三)利用ONCOMINE微阵列芯片数据库进行EIF3D在肾细胞癌与正常肾组织的mRNA表达水平的荟萃分析对5个肾细胞癌基因芯片数据库进行荟萃分析,EIF3D的mRNA表达水平在肾透明细胞癌中较正常肾组织显著上调(P=0.004)。通过对肾细胞癌亚型分析发现,恶性程度较高的肾透明细胞癌(CCRCC)和肾乳头状细胞癌(PRCC)的EIF3D表达水平较恶性程度较低肾嫌色细胞癌(CRCC)上调(P=0.002;P=0.010)。(四)在肾细胞癌细胞株中通过慢病毒介导稳定敲减EIF3D基因Western Blot检测肾细胞癌细胞株,786-O和ACHN细胞株的EIF3D表达水平较其他细胞株上调。786-O和ACHN细胞株感染慢病毒介导的sh RNA沉默EIF3D,Real-time PCR和Western Blot验证敲减效率,稳定沉默EIF3D细胞株模型成功建立。(五)EIF3D沉默显著抑制肾细胞癌细胞的增殖和克隆形成能力786-O和ACHN细胞在沉默EIF3D后,细胞生长曲线显著抑制较对照组(P<0.001)。克隆大小在沉默组和对照组显著存在差异,且沉默组的克隆数量显著少于对照组(786-O:P=0.0002;ACHN:P<0.0000)。(六)EIF3D沉默诱导肾细胞癌细胞G2/M期阻滞786-O和ACHN细胞在沉默EIF3D后,利用流式细胞分选技术发现EIF3D沉默组G2/M期细胞较对照组显著上调,同时sub-G1期的细胞累积。为了验证G2/M期阻滞的相关分子机制,Western Blot检测周期相关下游分子。结果发现沉默组周期相关蛋白CDK1和Cyclin B1蛋白表达水平下调,凋亡相关蛋白p21和RARP裂解产物上调。通过ONCOMINE基因数据库分析,EIF3D的表达水平与Cyclin B1(r2=0.2354,P<0.0001)and CDK1(r2=0.1332,P=0.0003)呈现正相关,同时与增殖相关分子标志物PCNA(r2=0.1687,P<0.0001)呈现正相关。五、结论1、EIF3D在肾细胞癌组织中显著上调,且与TNM分期呈正相关。2、EIF3D沉默诱导肾细胞癌细胞G2/M期阻滞通过下调Cyclin B1/CDK1信号通路,进而显著抑制肾细胞癌细胞的恶性增殖能力3、EIF3D作为一个有潜力的促肿瘤分子在肾细胞癌的发生进展起着至关重要的作用。