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研究背景：在西方国家,结直肠癌是发病率及死亡率均位于第三位的恶性肿瘤；在我国,结直肠癌发病率位于第三位,死亡率位于第五位,并且近几年结直肠癌的发病率及死亡率均呈上升趋势。结直肠癌的治疗方式有手术、化疗、放疗及分子靶向治疗等。其中,最有效的首选治疗方式为手术切除,但是目前临床上结直肠癌的早期诊断率很低,大部分病人确诊时已经属于中晚期,丧失了根治性手术的机会,因此大部分结肠癌患者需要内科化疗治疗。5-氟尿嘧啶(5-FU)自20世纪50年代上市以来,一直是治疗结直肠癌应用最广泛的首选药物,但是5-FU的耐药性及副作用成为成功化疗的障碍,其单药的客观有效率在20%左右。因此,研究如何提高结直肠癌细胞对5-FU的敏感性,从而延长患者的生命及提高患者的生活质量是非常有临床意义的。增殖诱导配体(a proliferation-inducing ligland,APRIL)是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族的一个新成员,其通过与特异性受体结合,参与促进多种肿瘤细胞增殖、延长肿瘤细胞存活及加速肿瘤形成等多个过程。在人体的正常组织中,APRIL的表达水平很微弱,但在多种肿瘤组织及细胞系(尤其是消化系统的肿瘤)中成高水平表达状态。本课题组的前期研究发现,APRIL在不同结直肠癌细胞株中表达水平存在差异性,在LOVO细胞、HCT116细胞中相对高表达,在SW480细胞、SW620细胞、HT29细胞中相对低表达,且表达水平的高低与5-FU耐药性成正相关。因此,本实验确定将LOVO细胞用于后期的实验研究。多肽类抗肿瘤制剂,目前已经成为研究分子靶向治疗肿瘤的新热点。多肽类制剂具有很多优点,如易于大规模合成、纯化简便,生物免疫原性低、组织渗透力强等。根据APRIL的生物学特性及APRIL抑制分子的研究现状,目前尚未发现利用多肽类制剂抑制APRIL的活性,进而达到抑制肿瘤细胞生长、提高5-FU的敏感性的研究报道。因此在我们的前期研究中,已经利用噬菌体筛选技术成功合成与sAPRIL具有高亲和力的结合肽,并已经通过体内和体外实验验证了sAPRIL结合肽的抑制结直肠癌生长的效应,但尚未完成验证sAPRIL结合肽提高5-FU的敏感性的研究。因此,本实验研究的是在本课题组前期实验研究的基础上,通过体内、体外两方面实验验证sAPRIL结合肽提高结直肠癌细胞对5-FU的敏感性,增强5-FU抑制及杀伤结直肠癌细胞的效应。第一部分细胞学体外实验研究sAPRIL结合肽提高结直肠癌LOVO细胞对5-FU的敏感性目的通过细胞学体外实验研究,验证sAPRIL结合肽提高结直肠癌LOVO细胞对5-FU的敏感性。方法1)细胞增殖实验：将处于对数生长期的LOVO细胞接种于96孔板中,第二天A组加入PBS, B组加入5-FU,C组加入sAPRIL结合肽,D组加入(5-FU+sAPRIL结合肽),处理48小时后,采用CCK-8法检测各组LOVO细胞的增殖抑制状态。2)细胞周期实验：将处于对数生长期的LOVO细胞接种于6孔板中,第二天A组加入PBS, B组加入5-FU,C组加入sAPRIL结合肽,D组加入(5-FU+sAPRIL结合肽),处理48小时后,采用细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒检测各组LOVO细胞的细胞周期分布情况。3)细胞凋亡实验：将处于对数生长期的LOVO细胞接种于6孔板中,第二天A组加入PBS, B组加入5-FU,C组加入sAPRIL结合肽,D组加入(5-FU+sAPRIL结合肽),处理48小时后,采用AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测各组LOVO细胞的凋亡情况。4)细胞周期相关蛋白及凋亡蛋白检测实验：将处于对数生长期的LOVO细胞接种于12孔板中,第二天A组加入PBS,B组加入5-FU,C组加入sAPRIL结合肽,D组加入(5-FU+sAPRIL结合肽),处理48小时后,采用Western blot检测各组LOVO细胞相关细胞周期及细胞凋亡蛋白的表达情况。5) caspase-3酶活性的检测：将处于对数生长期的LOVO细胞接种于6孔板中,第二天A组加入PBS, B组加入5-FU,C组加入sAPRIL结合肽,D组加入(5-FU+sAPRIL结合肽),处理48小时后,采用caspase-3酶活性检测试剂盒检测各组LOVO细胞的caspase-3酶活性。6) caspase-9酶活性的检测：将处于对数生长期的LOVO细胞接种于6孔板中,第二天A组加入PBS, B组加入5-FU,C组加入sAPRIL结合肽,D组加入(5-FU+sAPRIL结合肽),处理48小时后,采用caspase-9酶活性检测试剂盒检测各组LOVO细胞的caspase-9酶活性。7)统计学方法：采用SPSS13.0软件进行统计学分析,所有数据均采用均数±标准差(mean±SD)进行统计描述,多组间的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),首先进行方差齐性检验,若满足方差齐性,采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),组间两两比较采用LSD法；若不满足方差齐性,采用Brown-Forsythe近似方差分析,组间两两比较采用Dunnett s C法。结果1)细胞增殖实验：B组(5-FU组)细胞增殖抑制率为(37.62±7.07)%,C组(sAPRIL结合肽组)细胞增殖抑制率为(31.45±4.87)%,D组(5-FU+sAPRIL结合肽组)细胞增殖抑制率为(63.05±2.15)%。各实验组之间具有统计学差异(F=32.262,P=0.001),并且D组(5-FU+sAPRIL结合肽组)比B组(5-FU组)抑制细胞增殖的效应更明显,LOVO细胞生长更缓慢(P=0.001)。2)细胞周期实验：5-FU组细胞周期阻滞在S期,sAPRIL结合肽组细胞周期阻滞在G0/G1期,(5-FU+sAPRIL结合肽)组细胞周期阻滞在G0/G1期和S期,且S期阻滞效应显著强于5-FU组。3)细胞凋亡实验：A组(PBS组)、B组(5-FU组)、C组(sAPRIL结合肽组)、D组(5-FU+sAPRIL结合肽组)各组的早期凋亡率依次为(0.21±0.09)%,(12.8±0.30)%,(0.40±0.26)%,(17.1±0.66)%。各组之间具有统计学差异(F=1499.337,P=0.000)；D组(5-FU+sAPRIL结合肽组)比B组(5-FU组)诱导更多LOVO细胞凋亡(P=0.000)。4)细胞周期相关蛋白及凋亡蛋白检测实验：CyclinA及CDK2在B组(5-FU组)及D组(5-FU+sAPRIL结合肽组)呈高表达状态,且在D组(5-FU+sAPRIL结合肽组)表达水平更高；CyclinD1及CDK4在C组(sAPRIL结合肽组)及D组(5-FU+sAPRIL结合肽组)呈低表达状态；XIAP、Survivin、Bcl-2在B组(5-FU组)及D组(5-FU+sAPRIL结合肽组)呈低表达状态,且XIAP在D组(5-FU+sAPRIL结合肽组)表达水平更低；BAX在B组(5-FU组)及D组(5-FU+sAPRIL结合肽组)呈高表达状态。5) caspase-3酶活性的检测：A组(PBS组)、B组(5-FU组)、C组(sAPRIL结合肽组)、D组(5-FU+sAPRIL结合肽组)各组的caspase-3酶活性依次为(0.70+0.06) unit,(2.41±0.26) unit,(0.85±0.04) unit,(3.74±0.12) unit。各组之间具有统计学差异(F=201.259,P=0.000)；D组(5-FU+sAPRIL结合肽组)的caspase-3活性显著高于B组(5-FU组)(P=0.000)。6) caspase-9酶活性的检测：A组(PBS组)、B组(5-FU组)、C组(sAPRIL结合肽组)、D组(5-FU+sAPRIL结合肽组)各组的caspase-9酶活性依次为(0.62±0.06)unit,(1.99±0.12)unit,(0.74±0.06)unit,(3.31±0.18)unit.各组之间具有统计学差异(F=344.655,P=0.000)；D组(5-FU+sAPRIL结合肽组)的caspase-9活性显著高于B组(5-FU组)(P=0.000)。结论：在细胞学体外试验中,sAPRIL结合肽能够提高结直肠癌LOVO细胞对5-FU的敏感性。第二部分裸鼠体内实验研究sAPRIL结合肽提高结直肠癌对5-FU的化疗敏感性目的在裸鼠体内,验证sAPIL结合肽提高结直肠癌对5-FU的化疗敏感性。方法1)裸鼠成瘤：LOVO细胞消化传代,培养至对数生长期,台盼蓝证实细胞活力>95%,用盐酸磷酸缓冲液(PBS)制备成2×107/ml细胞悬液,20只4～6周BALB/c裸鼠,无特定病原体(SPF)条件下饲养,于每只裸鼠腋部背侧皮下注射0.1ml LOVO细胞悬液,裸鼠成瘤3周后肿瘤体积达到100～200mm3。2)实验分组及处理：3周后将成功成瘤的裸鼠随机分为4组,每组5只,A组腹腔及瘤内各注射0.1mlPBS,B组腹腔注射0.1ml5-FU溶液,瘤内注射0.1ml PBS,C组瘤内注射0.1ml sAPRIL结合肽溶液,腹腔注射0.1m1PBS,D组腹腔注射0.1ml5-FU溶液及瘤内注射0.1ml sAPRIL结合肽溶液。每2天给药1次,处理2周共7次,每次注射前测量瘤体体积,绘制肿瘤生长曲线。于注射结束后1周内处死全部裸鼠,取裸鼠肿瘤组织称重计算肿瘤生长抑制率。结果A组(PBS组)、B组(5-FU组)、C组(sAPRIL结合肽组)、D组(5-FU+sAPRIL结合肽组)瘤重分别为(346.55±26.34)mg,(238.16±19.11)mg,(257.66±18.47)mg,(170.53±19.58)mg,各组差异有统计学意义(F=59.039,P=0.000)；B组(5-FU组)、C组(sAPRIL结合肽组)、D组(5-FU+sAPRIL结合肽组)的抑瘤率分别为31.28%,25.65%,50.79%。结论在裸鼠体内,sAPRIL结合肽能够提高结直肠癌对5-FU的化疗敏感性。