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结肠癌(Colorectal cancer)是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一,其死亡率居肿瘤相关死亡率的第三位。在我国,结肠癌的发病率及死亡率也呈逐年上升的趋势。目前针对结肠癌的治疗手段仍以外科手术切除联合放化疗为主,但是患者仍会出现术后肿瘤复发和转移,严重危害患者的健康与生命。因此,急需寻找更合适及更有效的治疗结肠癌的方法。近年来,随着对恶性肿瘤的深入研究及肿瘤干细胞理论的提出,人们发现,肿瘤中存在极少数具有“干性”,能够自我更新并具有多向分化潜能的肿瘤干细胞(Cancer stem cell,CSC),与肿瘤发生发展、转移及复发密切相关。肿瘤干细胞理论认为,肿瘤干细胞是肿瘤的启动细胞,可能是恶性肿瘤形成的根源,只有靶向治疗肿瘤干细胞,才能最终治愈肿瘤。干性基因在干细胞的自我更新和分化中发挥关键作用,其中干细胞转录因子Nanog不仅在维持胚胎干细胞多能性和自我更新方面发挥重要作用,而且在多种肿瘤中异常表达。研究发现,Nanog的高表达与肿瘤不良预后密切相关,提示Nanog可能通过维持肿瘤干细胞的干性促进肿瘤的发生发展。因此,为了探究Nanog对结肠癌干细胞的生物学影响,本实验以Ep CAM和CD44为肿瘤干细胞筛选标志,通过免疫磁珠法从人结肠癌细胞系HCT-116中筛选出Ep CAM+CD44+HCT-116的人结肠癌干细胞(Colorectal cancer stem cell,CCSC),利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默结肠癌干细胞中Nanog的表达,探究其对结肠癌干细胞生物学行为的影响。结果显示,筛选获得的Ep CAM+CD44+HCT-116细胞在无血清DMEM/F12培养基中悬浮生长,由单个细胞逐渐长成肿瘤微球;经含血清培养基诱导后,细胞微球呈现贴壁分化状态。Real-time PCR检测结果显示:Ep CAM+CD44+HCT-116细胞中Nanog的m RNA表达显著高于未分选的HCT-116细胞(P<0.01);Ep CAM+CD44+HCT-116经Nanog si RNA作用48h之后,细胞中Nanog基因的m RNA和蛋白表达水平均显著下降(P<0.01,P<0.05)。MTS增殖实验显示Nanog基因沉默可显著抑制Ep CAM+CD44+HCT-116增殖(P<0.01)。Annexin V-FITC/PI双染法从细胞膜的完整程度上区分早、晚期凋亡细胞,结果显示:Ep CAM+CD44+HCT-116中Nanog基因沉默后,早、晚期凋亡细胞比例增加;JC-1法通过细胞膜电位的变化反映细胞凋亡情况,结果显示:Nanog基因沉默后细胞膜电位大幅度降低,凋亡细胞比例增加;Real-time PCR检测结果显示:Nanog基因沉默后,Ep CAM+CD44+HCT-116中抗凋亡基因Bcl-2的m RNA表达水平显著降低(P<0.05),而促凋亡基因Bax及Caspase-3的m RNA表达水平均显著升高(P<0.01);Western blot结果显示:Nanog基因沉默后,Ep CAM+CD44+HCT-116中cleaved-caspase3蛋白表达量显著增加(P<0.05)。Transwell小室结果显示:沉默Nanog基因可显著抑制Ep CAM+CD44+HCT-116的侵袭(P<0.01);同时Real-time PCR结果显示:Nanog基因沉默后,Ep CAM+CD44+HCT-116中促进侵袭基因MMP-2及MMP-9的m RNA表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01),而抑制侵袭基因Timp-1的m RNA表达水平显著升高(P<0.01)。动物实验结果显示,Nanog si RNA组肿瘤体积及瘤重显著低于对照组及空白组(P<0.05),并且Nanog si RNA组荷瘤鼠的生存期也显著长于对照组及空白组(P<0.05)。综上所述,Nanog沉默能够抑制结肠癌干细胞的增殖和侵袭,促进结肠癌干细胞的凋亡,并降低结肠癌干细胞的成瘤能力,这为针对结肠癌干细胞的靶向治疗提供了实验依据。