目的糖尿病脑病(Diabetic Encephalopathy,DE)是糖尿病引起的中枢神经系统并发症,以轻、中度获得性认知和行为功能障碍为主要临床表现。其病理特征与阿尔茨海默病(AD)极为类似,可观察到由β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成的神经炎性斑块及因tau蛋白过度磷酸化积聚而成的神经纤维缠结(NFTs)。Aβ是公认的神经毒性物质,异常磷酸化修饰的tau蛋白也在最近被发现具备朊蛋白毒性及侵袭力,目前观点认为这两种异常蛋白协同加速认知功能损害的进程,虽然意识到Aβ沉积增加及tau蛋白异常磷酸化修饰是DE发病的关键环节,但其致病机制尚不十分清楚。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)是细胞内重要的信号转导分子,与Aβ生成增加、tau蛋白过度磷酸化修饰密切有关。p38MAPK磷酸化水平升高既能增加tau蛋白异常磷酸化修饰,又能促进p53表达阻遏Sirt1。而Sirt1是调控α分泌酶、β分泌酶、自噬途径上关键蛋白表达的核心分子。但慢性高糖刺激是否通过上述信号通路途径引起糖尿病小鼠认知功能及诱导AD样病理改变发生尚需进一步证实。Toll样受体9(TLR9)是机体内重要的免疫调节受体,既往仅在免疫细胞及肿瘤细胞上发现TLR9表达,但最近研究证实实质细胞如神经元、心肌细胞,同样可在应激状态下表达TLR9并启动其非炎症信号通路,调节细胞内代谢活动。由于TLR9的非炎性信号通路即包括p38MAPK/p53,因此神经元上TLR9/p38MAPK/p53激活极有可能是DE发生的分子机制之一。本研究拟通过建立野生型及TLR9基因敲除小鼠的糖尿病模型,并结合基因沉默下调Sirt1技术,观察调控TLR9、Sirt1对小鼠认知功能、脑内Aβ,以及TLR9、P分泌酶、β分泌酶、自噬途径上关键蛋白的表达及磷酸化差异;拟通过离体糖尿病模型,并结合药物沉默/基因过表达技术抑制TLR9表达及p38MAPK活性/上调p53表达,以期阐明高糖损害认知、诱导Aβ生成增加及增加tau蛋白过磷酸化水平的潜在分子生物学机理。旨在明确高糖与认知功能障碍的关联,探讨TLR9介导AD样病变生成的分子信号级联机制,更新人们对DE的认识,并且强调糖尿病患者血糖管理的重要性。方法1、在体实验TLR9基因敲除、Sirt1基因沉默对糖尿病小鼠一般情况及认知功能的影响:(1)雄性野生型C57BL/6J小鼠、遗传背景相同的雄性TLR9基因敲除小鼠(C57BL/6J-T1r9M7Btlr/Mmjax,TLR9-/-型)8 周时,通过一次性腹腔注射STZ(野生型180mg/kg;TLR9-/-型130mg/kg)构建糖尿病模型,随访小鼠体重变化。(2)12周时双侧海马体注射生理盐水、空载病毒(HBAAV2/9-GFP,2μ1,滴度 1012v.g./mL)、Sirt1 沉默腺相关病毒(HBAAV2/9-U6-sirt1 gRNA8-cas9,2μ1,滴度 1012v.g./mL)。(3)Morris水迷宫(MWM)评估各组小鼠空间学习记忆能力,同时评估糖尿病对小鼠肌力及视力的影响。TLR9基因敲除、Sirt1基因沉默对糖尿病小鼠海马体TLR9、α分泌酶、β分泌酶、自噬途径上关键蛋白的表达的影响:(1)完成MWM认知评估后,免疫印迹(WB)检测小鼠海马体p53、Sirt1、Aβ表达情况。(2)WB检测Sirt1介导的α、β分泌酶途径及自噬途径上关键蛋白的表达变化情况。2、离体实验选择性抑制TLR9(ODN2088)、过表达p53基因对高糖环境下培养的HT22小鼠海马神经元细胞株内TLR9信号通路上关键蛋白、Sirt1、Aβ表达的影响(高糖干预的离体小鼠海马神经元可模拟体内神经元所处的高糖环境):(1)高糖(50mM)、ODN2088(5μM)、ODN2088 Contro1(5μM)、sh-p5 3(rLV-mP5 3-ZsGreen-Puro,滴度 108 TU/mL)处理HT22细胞株。(2)3日后WB检测TLR9及下游相关基因、Sirt1、Aβ的表达差异。选择性抑制 TLR9(ODN2088)、p38MAPK(SB203580)对高糖环境下培养的原代小鼠海马神经元内TLR9相关信号途径上关键蛋白、tau蛋白磷酸化的影响及可能的分子机制:(1)原代小鼠海马神经元培养7日,进行MAP2免疫荧光标记鉴定神经元。(2)予以高糖(50mM)、ODN2088(5μM)、ODN2088Contro1(5μM)、SB203580(20μM)处理。(3)3日后WB检测TLR9及其下游相关基因、Unc93b1表达,以及tau蛋白相关位点磷酸化水平差异。选择性抑制TLR9、p38MAPK,以及沉默p53基因对高糖环境下培养的小鼠海马神经元凋亡的影响:(1)原代小鼠海马神经元培养7日,予以高糖(50mM)、ODN2088(5μM)、ODN2088Contro1(5μM)、SB203580(20μM)处理3日,Tune1检测小鼠海马神经元凋亡率。(2)传代培养小鼠海马神经元HT22细胞株,予以高糖(50mM)、ODN2088(5μM)、ODN2088 Control(5μM)、sh-p53 处理,流式细胞Annexin-V检测小鼠海马神经元凋亡率。结果TLR9基因敲除、Sirt1基因沉默对糖尿病小鼠一般情况及认知功能的影响:(1)糖尿病模型成模后,与非糖尿病小鼠相比,糖尿病小鼠的体重增长幅度明显减缓、血糖值显著升高,但TLR9基因敲除、Sirt1基因沉默对各组小鼠的平均体重值及血糖值无影响。(2)MWM定位航行、空间探索试验分析,糖尿病小鼠的空间学习记忆能力受损,TLR9基因敲除可改善糖尿病小鼠认知功能障碍,但海马体Sirt1基因沉默会再次消除TLR9基因敲除对糖尿病小鼠认知功能的保护作用。在升平台实验中,各组小鼠找到平台的逃避潜伏期及每秒游泳速度无统计学差异。TLR9基因敲除、Sirt1基因沉默影响糖尿病小鼠认知功能的分子机制:(1)WB结果显示糖尿病小鼠脑内Sirt1表达显著下调,p53、Aβ表达明显增加;TLR9基因敲除可重新上调Sirt1,同时抑制p53、Aβ;选择性沉默Sirt1后,p53的表达无变化,但Aβ的生成再次明显增加,提示TLR9负调控Sirt1,介导糖尿病海马体Aβ生成增加。(2)WB结果分析各组小鼠海马体内Sirt1与α、β分泌酶途径、自噬途径上关键蛋白的表达变化发现,Sirt1与ADAM10的调控趋势一致,与BACE1相反,虽然糖尿病TLR9激活可上调自噬水平,但下调Sirt1对自噬活性物无影响,提示:Sirt1介导的α分泌酶途径受抑制、β分泌酶途径被激活是糖尿病海马体Aβ生成增加的分子病理机制。药理抑制TLR9可显著改善高糖环境培养下离体小鼠海马神经细胞内Aβ的蓄积,同时抑制p38MAPK、p53,并恢复细胞内Sirt1的表达水平。过表达p53基因对TLR9表达、p38MAPK磷酸化水平无影响,但可再次抑制Sirt1并导致神经细胞内Aβ含量增加,提示TLR9/p38MAPK/p53介导的Sirt1表达下调是糖尿病小鼠海马Aβ生成增加的关键环节。药理抑制TLR9表达及p3 8MAPK活化可显著降低高糖环境培养下离体小鼠海马神经元内tau蛋白异常磷酸化修饰水平。药理抑制TLR9表达及p3 8MAPK活化可显著降低高糖环境培养下离体小鼠海马神经元凋亡,过表达p53基因会逆转TLR9、p38MAPK抑制剂的神经保护效应。慢性高糖刺激可诱导Unc93b1的表达,进而导致小鼠海马神经元TLR9/NF-κB炎性信号通路激活,但此过程不受p38MAPK干扰。结论我们的研究结果表明,高糖介导的TLR9非炎症信号途径激活,是糖尿病小鼠认知功能障碍及AD样病变生成的重要原因。TLR9不仅通过激活p38MAPK/p53信号途径,导致Sirt1介导α、β分泌酶途径异常,引起小鼠海马体Aβ生成增加及学习记忆能力下降;而且通过p38MAPK介导tau蛋白过度磷酸化,其调控作用独立于TLR9/NF-κB途径;另外,TLR9/p38MAPK/p53激活与高糖诱导的神经元凋亡密切相关,这些研究提示TLR9/p38MAPK/p53在的发病中起着非常重要的作用,可作为潜在的分子诊疗靶点。深入DE机制的研究将更新人们对糖尿病中枢神经并发症的认识,并为更好的诊治该病提供新思路。