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研究背景:原发性肝癌简称肝癌,是全球发病率和死亡率排名第三的、严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤。在我国,每年有接近50万例的新发病例和超过40万例的死亡病例。临床治疗肝癌的最有效手段仍然是外科手术切除和肝移植。然而因为肝癌的发病隐匿、进展迅速、恶性程度高,绝大多数的肝癌病人在确诊时已经发展为临床晚期,失去了外科手术根除的最好机会,导致肝癌患者的5年生存率不到25%。目前,治疗肝癌除外科手术和肝移植依旧没有其他有效治疗途径,这一现状是与肝癌发病高度复杂性和不确定性紧密相关。到目前为止,仍然缺乏对肝癌发病的主要或关键因子的深入了解,还不能针对性设计和研发特异性的有效治疗药物或诊治手段。因此,寻找和研究肝癌发病的分子特征包括鉴定关键作用因子和诊治标志物,对发展针对性有效治疗手段具有重要的理论意义和广阔的应用前景。我们前期为了寻找肝癌发生过程中新的关键作用因子或诊治标志物,采用表达谱芯片的手段分析了肝癌组织和正常肝组织中差异表达基因谱,筛选到了一个变化明显的新基因LHX3。本研究拟进一步分析LHX3基因在肝癌组织、癌旁组织和正常肝组织中的表达变化,评价其在肝癌患者中的临床特征和生存预后意义,最后通过实验性研究确定LHX3基因在肝癌中临床预后意义的生物学功能基础。本研究在肝癌中发现和鉴定了一个潜在关键作用因子,为最终阐明肝癌发病机制和寻找有效的诊治标志物提供前期资料。研究目的:(1)探讨LHX3基因在正常的肝组织、肝癌组织、肝癌癌旁组织以及肝癌细胞株中的表达变化;(2)探讨LHX3基因蛋白表达与肝癌患者临床信息之间的关系,分析其表达的临床特征;(3)分析LHX3基因蛋白表达对肝癌患者生存时间的影响,评估其在病人生存预后中的意义;(4)分析LHX3基因在肝癌发生、发展中的主要生物学功能。研究方法:(1)采用实时定量-PCR和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法分别对正常肝组织和肝癌细胞、肝癌组织中LHX3基因mRNA的表达情况进行检测;(2)采用免疫组织化学(IHC)染色方法,检测肝癌组织和肝癌癌旁组织中LHX3蛋白表达的变化情况,并根据染色强度,以及染色阳性率,对LHX3蛋白表达进行定量;(3)通过SPSS22.0软件,采用t检验分析两组间的表达差异、采用卡方检验分析LHX3表达与肝癌患者临床资料信息之间的关联,采用单因素Kaplan-Meier以及多因素Cox-regression分析方法分析LHX3表达对肝癌患者生存预后的影响;(4)通过构建LHX3表达载体和干扰载体,分别转染该基因低表达和高表达的肝癌细胞株,分析LHX3外源性过表达或干扰LHX3内源性表达对肝癌细胞的迁移和侵袭的影响,初步确定LHX3基因在肝癌中的主要生物学功能。研究结果:(1)通过RT-PCR和RT-qPCR分析正常肝组织和肝癌组织中LHX3 mRNA水平表达发现,肿瘤组织中LHX3表达(4.511±0.4351)水平要显著高于正常组织中LHX3表达水平(2.609±0.4252),该结果得到了TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中独立肝癌队列数据的进一步验证。通过IHC分析190例肿瘤组织和40例癌旁组织中LHX3的表达,我们发现,LHX3在肿瘤组织中的表达(8.279±0.2025),也显著高于在癌旁组织中的表达(5.100±0.5838)。(2)LHX3表达与肝癌病人的临床分期(n=186,P=0.009)和肿瘤转移(n=184,P<0.001)密切相关,而与肝癌癌患者年龄、病理分级、性别和肿瘤大小不相关(P>0.05)。LHX3基因在临床晚期肝癌病人中的表达明显高于在临床早期肝癌病人中的表达(P=0.0019),并且LHX3基因在肿瘤转移病人中的表达也远远高于在非转移病人中的表达(P=0.0027)。(3)LHX3蛋白表达与肝癌病人是否感染丙型肝炎病毒相关(HCV,P=0.002),而且与临床标志物CD34的表达有关(P=0.043),但是LHX3蛋白表达与其他临床标志物表达如HEP1、C-ERBB-2、KI67、P53、HBCAG、AFP、CK8、CK19和HBSAG不相关(P>0.05)。(4)LHX3高表达肝癌患者总生存期时间明显变短(P<0.001),且该蛋白表达是一个独立的预后标记物(HR=1.964,P=0.004);并且LHX3表达在临床早期(I+II)病人和临床晚期(III+IV)病人中的预后意义存在差异,LHX3蛋白表达在临床晚期患者中是一个不利预后因素(P<0.001),并且是一个独立的预后因子(HR=2.285,P=0.008),而在临床早期患者中LHX3表达与病人总生存期不相关。(5)在肝癌细胞株外源性过表达LHX3基因能够显著增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力;而在肝癌细胞株干扰内源性LHX3基因,可以明显抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。研究结论:LHX3基因在肝癌中的表达明显升高,进一步分析发现,LHX3基因的表达与肝癌患者的临床分期和肿瘤转移密切相关;而且LHX3表达是晚期肝癌患者总生存期的不利预后因素和独立的预后因子,进一步功能分析发现LHX3基因能显著促进肿瘤的迁移和侵袭。这些结果表明,LHX3是一个潜在的晚期肝癌患者预后评估生物标志物和肝癌转移候选癌基因。